pcr引物设计(PCR引物设计时有哪些注意事项)
1.PCR引物设计时有哪些注意事项
引物设计参数：
a
引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。
b
引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3,primer
5,primer
6,primer
express等一般可以设置在55-58度，beacon
design可以设置在65左右。
c
GC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。
d
产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不易区分，超过200bp可能会影响PCR扩增效率。
e
软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。
f
引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。
2.PCR引物设计应该注意的问题?
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
3.PCR引物设计应遵循哪些原则
1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp;2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到 3'的下降形状也有利于引物与模板的结合；4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%,-8时少于20%,-10时接近于0;5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。
但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；8、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；9、以公式Tm=4*(G+C)+2*(A+T)-5计算Tm值，也就是退火温度。
选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。
13、对引物的修饰一般在5'端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。
4.pcr引物的设计有哪些要求
你首先要明白，引物是什么？为什么要设计引物？明白了之后，再去看资料和网上设计引物的介绍，一定能明白。
关于设计引物的步骤和注意事项，网上太多了，我相信你不是问这个，我跟你介绍一下设计引物的意义，说说实验里的作用吧。
基因都是串在基因组DNA或者载体上的，必须拿下来才能用，对吧？怎么拿下来呢？一般就是用PCR的方法，比如说有一串DNA链是这个样子：
---------++++++--------------------------
其中【++++】部分是你要的片段，其它都不要，那就用PCR反复扩增+++部分，最后就得到大量的片段。
可是怎么让PCR扩增的就是+++片段，而没有其他---片段呢？就得靠引物——根据++++片段两端的几个DNA序列，人工合成两个20来个碱基的短DNA，这段DNA可以和+++片段的两端互补结合，就把PCR的范围限定在两个合成的短DNA中间了。
这个短DNA，就是引物
明白了引物是什么，是干什么用的，你就可以下手了，先在NCBI上查找你的基因的序列，根据两头的DNA序列，设计18-22个配对的碱基，让公司去给你合成就行了。
当然，其中要注意的问题有很多，还涉及酶切位点等，你需要好好看书。
5.何谓PCR?PCR引物设计时有哪些注意事项（注：要考虑退火温度）
答：（1） 聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction）。
(2)PCR引物设计原则
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理：
② 引物长度
② GC含量，一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5'端加适量的A、T或G、C尾巴。
③ 退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃~6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃~75℃间变化。
④ 避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2'-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
⑤ 与靶DNA的错配
⑥ 引物末端
引物3'端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3'端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中，引物3′端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
⑦ 引物的二级结构
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
⑧ 为了下一步操作而产生的不完全匹配
5'端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。
