电泳实验应该(聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作过程中,应注意哪些事项?)
1.聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作过程中,应注意哪些事项?
一、凝胶制备时：TEMED和AP要后加，加入后用玻棒缓慢匀速的混匀，避免有气泡产生；然后马上注入电泳槽内，插入梳子，这时也要匀速，但不能太慢，因为太慢的话底部的胶会比上面的胶凝的快，影响胶的质量，同时小心有气泡；
二、加样时要注意：1.每空的上样量不能过大，以免样品溢出，造成各泳道相互污染；
2.为了避免边缘效应，在未加样的泳道加入等量的样品缓冲液。注意事项
(1)由于与凝胶聚合有关的硅橡胶称、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止引现象，所用器材均应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡沫海绵蘸取“洗洁净”仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液3~4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵蘸取“洗洁净”反复刷洗，最后用蒸馏水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。
(2)安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽板梳齿应平整光滑。
(3)在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶乡合后进行。洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。
(4)电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或过低无可影响电泳效果。
(5)SDS纯度：在SDS-PAGE中，需高纯度的SDS，市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。重结晶方法如下：称20g SDS放在圆底烧瓶中，加300ml无水乙醇及约半牛角匙活性碳，在烧瓶上接一冷凝管，在水浴中加热至乙醇微沸，回流约10min，用热布氏漏斗趁热过滤。滤液应透明，冷却至室温后，移至-20℃冰箱中过夜。次日用预冷的布氏漏斗抽滤，再用少量-20℃预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀3次，尽量抽干，将白色结晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。
(6)用SDS处理蛋白质样品时，每次都会在沸水溶中保温3~5min，以免有亚稳聚合物存在。
(7)标准蛋白质的相对迁移率最好在0.2~0.8之间均匀分布。值得指出的是，每次测定未知物分子量时，都应同时用标准蛋白制备标准曲线，而不是利用过去的标准曲线。用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整的分子量。为测得精确的分子量范围，最好用其他测定蛋白分子量的方法加以校正。此法对球蛋白及纤维状蛋白的分子量测定较好，对糖蛋白，胶原蛋白等分子量测定差异较大。
(8)对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10~15μl为宜，如样品系较稀的液体状，为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。
(9)由于凝胶中含SDS，直接制备干板会产生龟裂现象。如需制干板，则用25%异丙醇内含7%乙酸浸泡，并经常换液，直到SDS脱尽（约需2~3天），才可制备干板。为方便起见，常采用照像法，保存照片。
2.核酸凝胶电泳实验需要注意什么
1、加样时枪头不要碰坏孔壁，否则DNA带型不整齐。大多情况下，加样时不必更换枪头，可在阴极槽中反复吸打电泳缓冲液清洗，但对Southern 印迹转移和需回收DNA时，应每个样品使用新的枪头，以避免样品交叉污染。
2、上样缓冲液不仅提高样品的密度，使样品均匀沉到样孔底，还使样品带色，便于上样，估计电泳时间和判断电泳位置。
3、EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB的溶液也不应直接倒下水道，用后妥善净化处理：EB含量大于0.5μg/ml溶 液先用水将EB浓度稀释至0.5μg/ml以下，每100ml溶液加入100mg活性碳，不时轻轻摇荡混匀，室温放置1小时，滤纸过滤将活性碳与滤纸密封在塑料袋中作为有害废物丢弃。或用专用一次性染料清除袋（Gene有限公司）吸附过夜，再焚烧袋子即 可。
4、应在暗箱窗口观察结果，避免紫外线操作者的损伤。
5、电泳过程中，EB向阴极移动（与DNA相反），延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在 0.5μg/ml EB溶液中重新染色后检测。
6、加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.1~0.5μg即可有良好的观察效果。如 样品为酶切产物（由大小不同的DNA片段组成），每孔加20~30μg DNA也不致明显影响分辨率。
7、小的凝胶——微型凝胶和中型凝胶的电泳一般比大的凝胶要快，常常用于快速分析。当选择微型或中型凝胶装置时要考虑凝胶槽盛装缓冲液的体积，小胶 通常要在高压下电泳（>10V/cm），所以选择一个相对较大的缓冲液槽比较有利。
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详细资料请参考：on
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3.核酸凝胶电泳实验需要注意什么
大多情况下，加样时不必更换枪头，可在阴极槽中反复吸打电泳缓冲液清洗，但对Southern 印迹转移和需回收DNA时，应每个样品使用新的枪头，以避免样品交叉污染。
2、上样缓冲液不仅提高样品的密度，使样品均匀沉到样孔底，还使样品带色，便于上样，估计电泳时间和判断电泳位置。3、EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB的溶液也不应直接倒下水道，用后妥善净化处理：EB含量大于0.5μg/ml溶 液先用水将EB浓度稀释至0.5μg/ml以下，每100ml溶液加入100mg活性碳，不时轻轻摇荡混匀，室温放置1小时，滤纸过滤将活性碳与滤纸密封在塑料袋中作为有害废物丢弃。
或用专用一次性染料清除袋（Gene有限公司）吸附过夜，再焚烧袋子即 可。4、应在暗箱窗口观察结果，避免紫外线操作者的损伤。
5、电泳过程中，EB向阴极移动（与DNA相反），延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在 0.5μg/ml EB溶液中重新染色后检测。6、加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.1~0.5μg即可有良好的观察效果。
如 样品为酶切产物（由大小不同的DNA片段组成），每孔加20~30μg DNA也不致明显影响分辨率。7、小的凝胶——微型凝胶和中型凝胶的电泳一般比大的凝胶要快，常常用于快速分析。
当选择微型或中型凝胶装置时要考虑凝胶槽盛装缓冲液的体积，小胶 通常要在高压下电泳（>10V/cm），所以选择一个相对较大的缓冲液槽比较有利。……………………………………。
4.琼脂糖凝胶电泳测dna实验应注意哪些问题
凝胶电泳操作注意事项： 1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。
长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。
琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程 凝胶电泳操作注意事项： 1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。
2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。
小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
5.核酸电泳的注意事项
1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。
3. 电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应常更新电泳缓冲液。4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。
当加样孔大时，样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辩认不清；反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。5. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。
小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。回收率低或为零 1. 漂洗缓冲液中没加入乙醇.在使用前应确保乙醇已加入漂洗液PW中。
2. 吸附材料上有乙醇残留.洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留，因含乙醇会降低洗脱效率。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟，彻底去除漂洗缓冲液。
3. 洗脱缓冲液pH值偏低.DNA只在低盐buffer中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。
最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内。
4. 洗脱液加入位置不正确.洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面，达到最大洗脱效率。DNA质量不好 洗脱产物含有乙醇残留.洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。
在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟，彻底去除漂洗缓冲液。
