QPCR的化学方法(qPCR实验操作流程谁知道)

1.qPCR实验操作流程谁知道

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Q-PCR实验流程

一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。

二、总RNA抽提

1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min;

组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）

2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）

3) 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）

4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min;

5)4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；

6）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。

7）视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。

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三、去基因组

使用RNase-free的DNase І（Promega），按以下体系配置反应液，37℃消化30min,65℃灭活10min。

2.帮忙解释一下qPCR和FISH的原理

百度百科里有：

Realtime PCR（实时定量PCR）

定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。

实时荧光定量PCR 技术的主要应用：

1. DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等

2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等 ），特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证

3. 基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等

Realtime PCR 常用的两种方法分别为：Sybr green（荧光染料掺入法） 和Taqman probe （探针法）

SYBR green

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

此方法适用：

1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上

2、通用性好，不需要设计探针，方法简便，省时，价格低廉。

3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。

4、高通量大规模的定量PCR检测

5、专一性要求不高的定量PCR检测。

Taqman Probe

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

此方法适用：

1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。

2、适用于扩增序列专一的体系的检测。

3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。

4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。

5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。

6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量，在动物病原体基因的检测，畜禽产品的检验检疫，生物制品的鉴定。

（来源：GENELIFE Biotech 基莱生物）

3.请问什么叫QPCR

QPCR 问：什么是QPCR？答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。

即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。问：QPCR、DNA检测、PCR之间的关系？答：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction简称PCR）原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获93年诺贝尔化学奖。

因其在病原体检测方面的独特优势，因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流，至今仍处于学术和应用前沿：第一代产品：基因扩增热循环仪（DNA Thermal Cycler）+电泳仪+紫外分析仪+定性试剂，构成PCR定性检测。第二代产品：基因扩增热循环仪+荧光仪+终点定量试剂，构成PCR-DNA终点法定量检测（End-point quantitative PCR detection），又分为终点酶免定量（ End-point ELISA-PCR）和终点荧光定量（End-point Fluor-PCR）两种。

第三代产品：实时定量QPCR仪+实时荧光定量试剂，构成QPCR-DAN/RNA实时荧光定量检测。问：相比以前的方法，QPCR有哪些特点？答：QPCR至少有以下特点：所用仪器少，只用一台仪器。

检测时间短，只须45分钟~1小时10分钟（试剂各异），而定性PCR须3~4小时，酶免终点定量须6~8小时，荧光终点定量须2~3小时。操作极其简单：前处理后，样本插入仪器一小时后到电脑上来出报告即可，无须开盖，移样本（以前方法），避免污染。

结果精确：定性PCR只能定性，很粗略，终点定量PCR由于只能在40个热循环结束后检测荧光，被测荧光达到饱和导致定量不够精确，属于半定量状态。而实时荧光QPCR是在扩增的每时每刻连续检测各样本的荧光值的变化，如图一所示： 图一 西安天隆TL988实际曲线1检测动态范围：10~10000000000 DNA copies/ml检测精度：0.1RLU辨别率：5000和10,000个模板拷贝样本的辨别率99.7%。

问：QPCR的技术先进性、价格及应用现状？答：实时荧光QPCR是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇，被美国FDA批准并取得临床应用执照的QPCR试剂品种有：HBV乙肝病毒DNA,HCV丙肝病毒RNA,HIV艾滋病病毒RNA,Chlamydi trachomatis(CT)，性传播疾病，沙眼衣原体，Neiserria gonorrhea(NG)，性传播疾病，淋病双球菌，Cytomegalovirus(CMV)，性传播疾病，巨细胞病毒，Mybobacterium tuberculosis(Mtb)，呼吸道疾病，结核分支杆菌等。实时荧光PCR仪研发技术难度大，门槛高，发达国家也只有有限几家知名公司生产，且售价昂贵：如美国ABI/7700-120万元，美国ABI/5700-50万元，瑞士Roche/Lightcycler-70万元，美国Stratagene公司2005年新品MX3005P-80万元 可见，在病人看来，哪家医院应用了QPCR技术便是先进诊断技术的象征，在发达国家也是如此。

国产仪器情况：国产仪器生产单位不超过五家，其中包括：日本独资杭州博日实时荧光QPCR仪（33孔）西安天隆科技有限公司TL988实时荧光QPCR仪（48孔） 以上产品均取得国家SFDA认证，报价均在45万以上。 国产试剂情况：多家公司生产实时荧光QPCR试剂盒，价格与终点法试剂相当，且品种齐全，价格便宜，购买方便：乙肝HBV-DNA，丙肝HCV-RNA，艾滋AIDSHIV-RNA，性病系列：淋病双球菌NG、沙眼衣原体CT、解脲支原体UU、疱疹病毒HSV、人体乳头瘤HPV，优生优育系列：巨细胞病毒CMV、弓形虫COX等。

编辑词条 开放分类：病毒、DNA、PCR、分子生物、实时荧光定量PCR仪 参考资料： 1. /pcr%D2%C7 2. 贡献者：zhang120jing、弦之月NONO。

4.定量分析方法有哪些

有五种，分别是：

1、比率分析法。根据不同数据做对比，得出比率。

2、趋势分析法。根据一阶段某一指标的变动绘制趋势分析图。

3、结构分析法。根据某一指标占总体的百分比来观察。

4、相互对比法。选取某两个指标作为一组进行对比。

5、数学模型法。建造适合某一指标的数学模型来观察指标的变化。

以上五种定量分析方法，比率分析法是基础，趋势分析、结构分析和对比分析等方法是延伸，数学模型法代表了定量分析的发展方向。

拓展资料：

定量分析法（quantitative analysis method）是对社会现象的数量特征、数量关系与数量变化进行分析的方法。在企业管理上，定量分析法是以企业财务报表为主要数据来源，按照某种数理方式进行加工整理，得出企业信用结果。定量分析是投资分析师使用数学模块对公司可量化数据进行的分析，通过分析对公司经营给予评价并做出投资判断。定量分析的对象主要为财务报表，如资金平衡表、损益表、留存收益表等。其功能在于揭示和描述社会现象的相互作用和发展趋势。

百度百科-定量分析

5.化学检测的方法有哪些

化学检测的方法有哪些

一般分有机颜料，如酞青绿等；无机颜料如氧化铁红、钛白；染料如还原桃红、分散橙等.聚烯烃、PVC色母粒采用的是颜料，一般说染料不可用于聚烯烃着色，否则会引起严重迁移.

二、分散剂主要对颜料表面进行润湿，有利于颜料进一步分散，并稳定在树脂中，同时必须与树脂相容性好，不影响着色产品品质.聚烯烃色母粒分散剂一般采用低分子量聚乙烯蜡或硬酯酸锌等.工程塑料色母粒分散剂一般采用有极性低分子量聚乙烯蜡、硬酯酸镁、硬酯酸钙等.三、载体树脂

使颜料均匀分布并使色母粒呈颗粒状.选择载体需考虑与被着色树脂的相容性，还要考虑母粒应有良好分散性，因此载体的流动性应大于被着色树脂，同时被着色后不影响产品质量.如选用熔体指数较大的同类高聚物，使母粒的熔体指数较高于被着高聚物，以保证最终制品的色泽一致.

6.分析化学实验的分析方法有哪些

如果你指的是定量分析化学，分析方法有重量法和滴定法

重量法包括沉淀重量法、气化法、电解法、萃取法等，重量分析方法适合于常量分析，相对误差较小，但操作繁琐，耗时较长。

滴定法包括酸碱滴定、配合滴定、氧化还原滴定、沉淀滴定四种方法。该方法简便、快速、有足够的准确度，相对误差较小，主要用于常量组分测定，但需要特定的指示剂。

有时候吸光光度法也被划入化学分析的范畴，主要是因为吸光度测定前通常需要一个配合显色的过程，这是一个化学过程。