植物遗传转化的(植物体杂交注意事项)
1.植物体杂交注意事项
植物体细胞杂交（plant somatic hybridization），又称原生质体融合（Protoplast fusion ）是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。植物细胞具有细胞壁，未脱壁的两个细胞是很难融合的，植物细胞只有在脱去细胞壁成为原生质体后才能融合，所以植物的细胞融合也称为原生质体融合。
说道植物细胞融合，它和动物细胞融合还是有很大差别的。
第一，前者因为有细胞壁，对融合有负面影响，首先要除壁变成原生质体，可以用纤维素酶和果胶酶除壁。
第二，后者除了要加必要的营养物质外，还要加血清保持环境稳定。
细胞融合方法主要有化学、生物和物理方法。一般学生实验室使用PEG（主要含有聚乙二醇）法融合。其优点是操作简单不需要特殊的设备。只需在去壁的细胞加入适量的PEG处理适当的时间，然后终止PEG的作用，然后在普通光学显微镜即可看到融合细胞。这种方法也有缺点，如不好控制PEG作用的时间，而且PEG对细胞也可能有害。
只有处理时间得当，细胞壁去除了才可能提高成活率。
优点：植物体细胞杂交是两种异源原生质体，在诱导剂诱发下相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞，进一步发育成杂种植物体。通过细胞融合技术可以克服种、属以上职务有性杂交不亲和障碍，为广泛重组遗传物质开辟了新途径，也为携带外源遗传物质（信息）的大分子渗入细胞创造了条件，从而更进一步扩大了遗传物质的重组范围。
2.农杆菌介导的遗传转化过程中为什么必须要诱导植物regeneration
几种常用的植物转基因方法
遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养再生植株可分成两大类，第一类据要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法。
1农杆菌介导转化法
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双于叶植物的受伤部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双于叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
2基因枪介导转化法
利用火爆炸或高压气体加速（这一加速设备被称为基因枪），将包裹了带目的基因的
DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细脑和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。
3花粉管通道法
在授粉后向于房含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于印年代初期由我国学者周光字提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。
3.植物染色体标本的制备的注意事项
植物染色体制片技术是植物细胞遗传学、染色体工程、植物细胞生物学、植物细胞分类学和物种生物学等众多学科的基本实验技术。植物染色体的研究由于和植物遗传育种工作的结合而获得良好的发展。因此，植物染色体的技术在这些研究工作中具有特别重要的意义[1-3]。Belling(1921)提出染色体压片技术后，植物压片已成为植物染色体研究中广泛应用的常规技术[1]。但是由于植物细胞有很坚实的细胞壁，染色体很难像动物染色体那样平整地贴在载玻片上。陈瑞阳（1982）提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗法。本文以韭兰为材料，对植物染色体常规压片，去壁低渗法制片技术、染色效果进行了比较，以期在不同的材料及条件下选择适宜的染色体制片技术，从而获得较好的效果。
1 材料与方法
1.1 供试材料 试验用植株由校园内采集。
1.2 根尖制片
1.2.1 常规压片 通常是在早上9-10点采集葱兰的根然后在室温下放入0.1%秋水仙素溶液中进行预处理处理8 h。然后就在常温把材料放在卡诺氏固定液下固定10m，接下来就在1 mol/L盐酸溶液中解离到松软刚合适为止。最后是用蒸馏水将葱兰根冲洗干净，这样前处理就结束。处理完后就可以用醋酸洋红染色或改良苯酚品红染色[4]。压片/涂片后选取典型的染色体，在40倍物镜及油镜下显微照相。
1.2.2 去壁低渗法 去壁低渗法也是把材料放0.1%秋水仙素溶液中进行预处理处理8 h。然后前低渗即是将根尖放在0.075 tool/L KCI低渗液中，在20~25℃条件下处理0.5h。接下来就是最关键的去壁，倒去KCI溶液，加入2.5%混合酶液，在25~30℃温度下处理2~5 h左右。去壁后要进行后低渗，使细胞完全胀，即是用20~30℃蒸馏水慢慢冲洗2~3次后，再将根尖放在0.075 tool/L KCI低渗液中处理。
4.试述农杆菌介导的植物遗传转化中外植体培养主要有哪些阶段
1.种子消毒
成熟的水稻（Rice）种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75%酒精浸泡1-2 min，无菌水冲洗2次；再用30% NaClO消毒30 min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上，每皿约30粒，于28℃暗培养。
2.继代培养
经过近1月的诱导，水稻（Rice）长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上进行继代。每2周继代一次，一般继代2-4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。
3.农杆菌的培养
在转化平板上挑取单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基（含相应抗生素（antibiotic））中加入1ml上述培养物，200rpm,28℃培养5-6hr至OD600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮（AS，终浓度100uM）。取上述菌液在室温下，4000rpm,10min，弃上清，加入MS液体培养基（含AS 100uM）重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600=0.5左右，此时可用来转化愈伤组织。
4.共培养
将水稻（Rice）胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + AS 100 uM）上，28℃暗培养三天。
5.洗菌
共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef 250 mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。
6.选择培养
将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + Cef 250 mg/L）上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 50 mg/L + Cef 250 mg/L）上，再选择3周。
5.分化培养
将经过2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 5 g/L + 麦芽糖30g/L）上暗培养10天左右，再转到分化培养基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 麦芽糖30 g/L）上光照培养。
7.生根培养
约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基（1/2MS + NAA 0.5 mg/L + Hyg 15 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 蔗糖20g/L）上诱导不定根的发生。
8.转基因苗的移栽
当幼苗长至10cm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
