淀粉酶活性的测定(酶活力测定的注意事项有哪些)
1.酶活力测定的注意事项有哪些
1.底物浓度 除选择适合的底物外，在实际应用中更多考虑的是底物浓度。由于[S]与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。[S]范围一般选择在10~20Km为宜，此时反应速度基本达到最大反应速度，测定的误差在可接受范围。
2.酶浓度 在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说，只有[S]>>[E]时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。
3.温度 不同的酶最适温度可以不同，多数酶的最适温度在37~40℃，高于或低于最适温度，酶活性都降低。目前，酶活性的测定温度尚未统一，但常规实验室多使用37℃。温度对酶促反应的影响程度通常用温度系数（Q10）表示。温度系数指温度每升高10℃，化学反应速度增加的倍数。Q10通常为l~2。由温度系数得知，温度的变化对酶活性有着重要影响，因此要求酶活性测定要在恒温条件下进行，温度波动要控制在±1℃。
4.离子强度和pH值 在最适pH时，酶的活性最强，高于或低于最适pH，酶的活性都降低，多数酶的最适pH在5~8之间。在测定酶活性时，要求缓冲液具有足够的缓冲容量，以便使pH值保持稳定。血浆或血清标本含有多种缓冲溶质，具有较强的缓冲能力。为了防止血浆或血清标本缓冲溶质对反应液酸碱度的影响，使pH不致偏离设定值，标本用量不宜过大，血浆或血清标本体积/反应液体积≤1/10为宜。
5 辅助因子 某些金属离子和维生素类辅酶是结合酶的辅助因子，例如Zn2+是羧基肽酶的辅基，Mo6+是黄嘌呤氧化酶的辅基，NADH是不需氧脱氢酶的辅酶。这些酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性，因此在酶活性测定时，就要保证辅基或辅酶的供给。
6.激活剂 有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活剂，Cl-是淀粉酶的激活剂。因此在酶活性测定时，也要满足酶对激活剂的需要。
7.抑制剂 酶的抑制可分为不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。重金属离子和砷化物对巯基酶的抑制、有机磷对羟基酶的抑制属于不可逆抑制；丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制、磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的抑制属于竞争性抑制；哇巴因对Na+,K+-ATP酶的抑制属于非竞争性抑制。抑制剂使酶活性降低，在测定酶活性时，应避免抑制剂的影响。
综上所述，测定酶活性时，最适条件的选择应该遵循最适底物浓度、最适温度、最适pH值、满足辅助因子和激活剂、避免抑制剂的原则。
2.酶活力测定的注意事项有哪些?
1.底物浓度 除选择适合的底物外，在实际应用中更多考虑的是底物浓度。由于[S]与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。[S]范围一般选择在10~20Km为宜，此时反应速度基本达到最大反应速度，测定的误差在可接受范围。
2.酶浓度 在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说，只有[S]>>[E]时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。
3.温度 不同的酶最适温度可以不同，多数酶的最适温度在37~40℃，高于或低于最适温度，酶活性都降低。目前，酶活性的测定温度尚未统一，但常规实验室多使用37℃。温度对酶促反应的影响程度通常用温度系数（Q10）表示。温度系数指温度每升高10℃，化学反应速度增加的倍数。Q10通常为l~2。由温度系数得知，温度的变化对酶活性有着重要影响，因此要求酶活性测定要在恒温条件下进行，温度波动要控制在±1℃。
4.离子强度和pH值 在最适pH时，酶的活性最强，高于或低于最适pH，酶的活性都降低，多数酶的最适pH在5~8之间。在测定酶活性时，要求缓冲液具有足够的缓冲容量，以便使pH值保持稳定。血浆或血清标本含有多种缓冲溶质，具有较强的缓冲能力。为了防止血浆或血清标本缓冲溶质对反应液酸碱度的影响，使pH不致偏离设定值，标本用量不宜过大，血浆或血清标本体积/反应液体积≤1/10为宜。
5 辅助因子 某些金属离子和维生素类辅酶是结合酶的辅助因子，例如Zn2+是羧基肽酶的辅基，Mo6+是黄嘌呤氧化酶的辅基，NADH是不需氧脱氢酶的辅酶。这些酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性，因此在酶活性测定时，就要保证辅基或辅酶的供给。
6.激活剂 有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活剂，Cl-是淀粉酶的激活剂。因此在酶活性测定时，也要满足酶对激活剂的需要。
7.抑制剂 酶的抑制可分为不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。重金属离子和砷化物对巯基酶的抑制、有机磷对羟基酶的抑制属于不可逆抑制；丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制、磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的抑制属于竞争性抑制；哇巴因对Na+,K+-ATP酶的抑制属于非竞争性抑制。抑制剂使酶活性降低，在测定酶活性时，应避免抑制剂的影响。
综上所述，测定酶活性时，最适条件的选择应该遵循最适底物浓度、最适温度、最适pH值、满足辅助因子和激活剂、避免抑制剂的原则。
3.测定酶活性时应注意些什么?
酶的活性测定要求有适宜的特定反应条件，应注意影响酶促反应速度的各种因素应该相对恒定。
1.酶的样品应做适当的处理。2.反应体系中，底物的量足够使酶被底物饱和，以充分反映待测酶的活力。
但过高的底物浓度可能抑制酶的活性，一般底物浓度在10km以上。3.测定代谢物时应保持酶的足够浓度。
4.应根据反应时间选择反应的最适温度。5.根据不同的底物和缓冲液选择反应的最适pH。
6.为获取最高反应速度，在反应体系中应含有适宜的辅助因子，激活剂等。7.测定酶活性时应测定酶促反应的初速度。
4.在实验过程中应注意哪些问题,才能确保淀粉酶活性?
淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。
淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。淀粉酶活性中度或轻度升高还可见于一些非胰腺疾病，如腮腺炎、急性腹部疾病（消化性溃疡穿孔、上腹部手术后、机械性肠梗阻、肠系膜血管病变、胆道梗阻及急性胆囊炎等）、服用镇痛剂、酒精中毒、肾功能不良及巨淀粉酶血症等情况，应加以注意。
5.淀粉酶活力的测定
谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定 几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。
主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。
α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原性糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。本实验以萌发种子为材料，测定其中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的差异。
【原理】 两种淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在PH3ر6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃下15Min则被钝化。据此，在测定时钝化其中之一，就可以测定出另一种酶的活力，本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力，再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较，求出β-淀粉酶活力。
淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
【仪器与用具】 分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵；具塞刻度试管25Ml 13支，刻度吸管1ml、2ml、5Ml各1支；容量瓶50Ml 2支。 【试剂】 麦芽糖标准液（1Mg/Ml）：称取100Mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100Ml。
DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20Ml 12Mol/L NAOH溶液中，加入50Ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100Ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。
若溶液混浊，可过滤后使用。 0ر1Mol/L PH5ر6的柠檬酸缓冲液：A液（0ر1Mol/L柠檬酸）：称取分析纯柠檬酸21ر01g，用蒸馏水溶解并定容至1L;B液（0ر1Mol/L柠檬酸钠）：称取柠檬酸钠29ر41g用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55Ml与B液145Ml混匀，即为0ر1Mol/L PH5ر6的柠檬酸缓冲液。
1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100Ml 0ر1Mol/L PH5ر6的柠檬酸缓冲液中。 【方法】 1.酶液提取称取25℃下萌发3~4天的小麦种子1ر0g（芽长1ر0~1ر5CM），置研钵中，加少量石英砂和2Ml蒸馏水，研磨成匀浆后转入离心管中，用7Ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管，提取液在室温下放置提取15~20Min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。
然后在3000r/Min转速下离心10Min，将上清液倒入50Ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5Ml，放入50Ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。
2ر麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表18-1加入试剂： 表18-1制作麦芽糖标准曲线配方表 试剂管号1234567麦芽糖标准液（ml）00.20.40.81.21.62.0蒸馏水（ml）2.01.81.61.20.80.40麦芽糖含量（mg）00.20.40.81.21.62.03,5-二硝基水杨酸（ml）2222222摇匀，置沸水浴中煮沸5Min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20Ml。
以1号管作为空白调零点，在540nM波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3ر酶活力的测定取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表18-2进行操作。 表18-2酶活力的测定配方表 操作项目管号Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3淀粉酶原液（ml）1.01.01.0000钝化β-淀粉酶置70℃水浴中15Min，取出后在流水中冷却淀粉酶稀释液（ml）000111DNS试剂（ml）2.0002.000预保温40℃恒温水浴中保温10Min1%淀粉溶液（ml）(40℃)1.01.01.01.01.01.0保温40℃恒温水浴中准确保温5MinDNS试剂（ml）02.02.002.02.0摇匀，置沸水浴中5Min，取出后冷却，加蒸馏水至20Ml，摇匀，在540nM波长下比色，记录测定结果。
4ر结果计算 用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（Mg），再按下式计算α-淀粉酶的活力（Aα），淀粉酶活性以每克鲜重所含麦芽糖毫克数（Mg/g·Min）表示： Aα=CαVTFW*t*V1(18-1) Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（Mg），按式18-1计算（α+β）-淀粉酶的活性AT AT=CT*VTFW*t*V1 式中A：淀粉酶活性，Aα为α-淀粉酶的活性，AT为淀粉酶总活性，主要是α、β-淀粉酶的活性； Cα：α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量（查标准曲线求值，以下同）； CT：（α+β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量； V1：显色所用酶液体积（Ml）; T：酶作用时间（Min）; VT：样品稀释液总体积（α-淀粉酶为50Ml，α+β淀粉酶为500Ml）; FW：样品鲜重（g）。 【思考题】 1.萌发种子和干种子α-淀粉酶和β-淀粉酶活力有何差异这种变化有何生物学意义 2ر实验中设置对照的意义何在 3رα-淀粉酶和β-淀粉酶性质有何不同作用特点有何不同。
6.淀粉酶活力的测定
-淀粉酶活力测定 α-淀粉酶活力测定
Yoo改良法：两份各5 ml 0.5%淀粉（用pH6.0 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制） 分别标记为A、B，放入40℃恒温水浴中保温10分钟，A中加0.5 ml酶液，B中加0.5 ml dH2O，反应5 min后，各加5 ml 0.1 mol/L H2SO4终止反应。分别从A、B取0.5 ml反应液加入到于5ml 0. 4mmol/L I2-KI溶液显色，620nm处测光密度OD。活力单位定义：5 min内水解1mg淀粉的酶量。A(U/ ml) = ( R0-R)/ R0 *50*D
A：酶活； R0:B对应的光吸收值；R:A对应的光吸收值； D：酶的稀释倍数
