mrna提取(RNA提取分离纯化时应注意什么?)
1.RNA提取分离纯化时应注意什么?
真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5'端帽子结构（m7G）和3'端的Poly(A)尾巴。
绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3'端存在20-30个腺苷酸组成的Poly(A)尾，通常用Poly(A+)表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3'末端含有Poly(A+)的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA 一、试剂准备 1.3M醋酸钠（pH 5.2） 2.0.1M NaOH 3.1*上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS（十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。
4.洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS 5.无水乙醇、70%乙醇 6.DEPC 二、操作步骤 1.将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。 2.用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。
3.使用1*上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。 4.将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2*上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。
当RNA上样液全部进入柱床后，再用1*上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。 5.将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。
6.用5-10倍柱床体积的1*上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。
后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。 7.用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。
8.OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。 9.4℃离心，10000g*15min，小心吸弃上清。
用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。
4℃离心，10000g*5min，弃上清，室温晾干。 10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事项 1.整个实验过程必须防止Rnase的污染。 2.步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。
所以此步骤不能省略。 3.十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4.寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。
5.一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
2.mRNA提取
一、材料 水稻叶片或小鼠肝组织。
二、设备 研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。 三、试剂 1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0。
01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
3、1*层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7。 6),0。
5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA(pH8。0),0。
1% SDS。 4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7。
6),1mmol/L EDTA (pH8。0),0。
05% SDS。 四、操作步骤 （一）动植物总RNA提取-Trizol法 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0。
2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0。
5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。 4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 [注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 （二）mRNA提取 由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。
1、用0。1mol/L NaOH悬浮0。
5-1。0g oligo(dT)纤维素。
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0。5-1。
0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8。
0。 4、将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。 6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。
7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5。 2), 2。
5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20℃30分钟。 8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。
9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。 10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0。
3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0。 02%叠氮钠（NaN3）冰箱保存，重复使用。
每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。 。
3.请教：提取RNA 和反转录的操作注意事项
你按照买的反转录试剂盒来做就行.
(1)、从细胞中提取细胞总RNA
用GIBCO公司的Trizol试剂提取细胞总RNA.按试剂使用说明操作：离心收集细胞，倾去细胞液，向沉淀中加1 ml Trizo1（每106-107细胞），混匀至室温5分钟，用1 ml加样器反复吹打，直至细胞完全裂解成均一溶液，不粘稠时为止.随后加入200ul氯仿，剧烈振荡15秒钟，室温放置5分钟，然后，4 0C ,12000rpm离心5分钟，将上层水相转移至一Eppendorf管中，加入500ul异丙醇后混匀.4 0C , 1 5000rpm离心15分钟，倾出异丙醇.用70%乙醇洗涤沉淀一次，置冰上，让残余乙醇挥发殆尽.溶于适量的DEPC水中，紫外分光仪测定RNA的纯度及含量，分装冻存于一700C保存.
(2)、反转录成cDNA第一链（参照产品说明）
在20ul体系中，加入1ug总RNA, 1 ul oligo dT12_l8 ( 500ug/ml ). RNase-Free水，70 0C温育10分钟后立即冰浴冷却，继续加入4ul 5 x Buffer, 2ul 0.1 M DTT, 1ul IOMm dNTPs ( IOMm/种)，混匀后于42℃保温2分钟，加入1ul( 200U)的反转录酶，42℃继续温育50分钟.700C 15分钟灭活反转录酶.
(3)、引物设计
(4)过程： 以1ulcDNA为模板，在50ul体系中含有Taq酶为2单位，dNTPs浓度为200uM，引物各为0.2uM.扩增22个循环.取8ul电泳.
