elisa血清稀释(ELISA实验的操作注意事项有哪些)

1.ELISA实验的操作注意事项有哪些

1.储存.

收到试剂盒后应尽快放入冷藏室内保存，保存温度为4℃-8℃.

2.回温.

试剂盒在使用前应于室温（22-27℃）下充分回温，回温时间为40-60分钟.回温过程中勿将酶标板的包装袋开封，回温结束后再将其从包装袋中取出使用.

3.样品稀释.

样品稀释应严格按照说明书要求的稀释倍数进行稀释.如稀释倍数过大，可采用多步法进行样品稀释.例如：试剂盒要求样品需进行500倍稀释，可吸取5μl样品加入245μl样品稀释液中，充分混匀后，再吸取10μl混合液加入90μl样品稀释液中即可.

4.加样.

稀释好的样品在加入酶标板进行孵育的过程中，尽可能缩短第一次加样和最后一次加样的时间间隔，样品加好后马上开始计时.

5.洗板.

样品孵育时间结束后，马上甩去孔内液体.如多块酶标板需同时洗涤，可先将板内液体甩去，倒扣于吸水纸上，再依次进行洗涤.使用洗板机洗涤时，建议洗涤次数增加一次.未用完的洗涤液可在4℃-8℃下密封保存1月.

6.显色.

底物药片可在显色前3-5分钟加入底物缓冲液中，混合直到完全溶解.本试剂最好是现用现配，未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周.

7.终止及读数.

提前打开酶标仪，加入终止液后立即读数.

8.同批号试剂盒中的试剂，除酶标二抗及阳性对照外，其余均可通用.

9.移液器的正确使用、保存、清洁、校对.

10.实验室管理

桌面保持整洁，插枪头戴手套等.

2.ELISA 实验注意事项知多少

？优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。

ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点（珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，须严格遵照规程操作）。

标本的采取和保存 通常我们可用于ELISA检测的样本是有多种类型的，如血清、血浆、尿液、细胞培养上清或组织匀浆液等，不同类型的检测样本前期的处理方法是不一样的。正确的处理样本是保证ELISA检测的正确性和准确性的第一步，下面简单介绍一下不同类型的样本的处理方法。

血清 血清是最常用于ELISA检测的一类样本，处理也比较简单。 用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本，将试管或离心管室温放置2小时或4℃过夜，使血清析出。

（最好将试管或离心管倾斜放置，使液面横截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃1000*g离心20min，仔细收集上清。

建议将血清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。 采血过程中应避免溶血，因为红细胞裂解时会释放具有过氧化酶活性的物质，在以HRP为标记的ELISA检测中会有非特异性的显色，而导致检测的不准确性。

同时也应避免细菌污染，因为菌体内可能含有内源性的HRP从而导致检测的假阳性。 血浆 用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本，标本采集后30min内4℃1000*g离心15min，取上清即血浆。

将上清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。避免使用溶血或高血脂的标本。

常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠和枸橼酸钠等，检测时还应仔细阅读试剂盒说明书，检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。 细胞培养上清 取细胞培养上清到离心管，1000*g离心20min，除去细胞碎片及杂质，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

细胞裂解液 1） 吸去培养板内的培养基，用胰酶消化细胞，加适量培养基将细胞从培养板上吹下来。悬浮细胞可省略。

2） 收集细胞悬液，1000*g离心10min，弃去培养基，用预冷的PBS润洗3次。 3） 加入适量的预冷PBS或细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。

通常6孔板一个孔的细胞量需要150~250μL PBS重悬。 4） 将样品放入-20℃或-80℃，使样品冷冻，再放室温解冻样品，反复冻融几次，使细胞充分裂解。

也可将样品进行超声破碎，以达到裂解的目的。 5) 4℃10000*g 离心10min，除去细胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

组织匀浆液 1） 将组织样本用PBS (0.01M, PH 7.4) 冲洗，洗去组织表面残留的血液或杂质。 2） 将组织块称重，记录后剪碎，碎块应尽量小，便于匀浆得更充分。

3） 将组织按一定的比例加入预冷的PBS（临用前加入蛋白酶抑制剂）匀浆，匀浆时置于冰上或冰浴中。（通常按组织重量：PBS体积=1:9的比例匀浆，例如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，检测后计算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数）。

4） 吸取匀浆液到离心管，4℃5000*g 离心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。 尿液、唾液等其他液体生物样本 1000*g离心20min，取上清即可检测。

总的来说，因为ELISA只能检测可溶性蛋白的含量，所以应保证所有样本均为澄清的液体，沉淀或悬浮物都应离心去除。 为了保证检测的准确性，保存于-20℃或-80℃的样本最好在1~6个月内检测；4℃保存的样本应在1周内进行检测。

另外，还应保证样本不含NaN3，因为NaN3会抑制HRP的活性，从而导致假阴性的结果。 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。

ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液、洗涤液应用pH计测量。

从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用，一般室温平衡不低于30min。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

加样 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样（一般不建议使用）。

有些指标检测（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1min。

加酶结合物工作液和底物工作液时可用多道移液器，使加液过程在最短时间内完成。 保温 在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。

抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育（incubation），有人称之为孵育。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。

以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需。

3.怎样正确溶解与稀释ELISA标准品

ELISA标准曲线是结果计算的尺子，标准品是ELISA 实验成功与否的关键点。怎样正确溶解、稀释标准品呢？

1. 粉末标准品短暂离心，让因运输沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。

2. 根据瓶标签加入一定体积的蒸馏水，加水后轻柔涡旋震荡，室温静置溶解 10-30min，让粉末完全溶解。

注意：加水后暂不用移液枪吹吸，避免蛋白未溶解，枪头带出部分蛋白，待完全溶解后可吹吸或涡旋振荡混匀。

3. 标准品梯度稀释：

(1)标准品稀释液的选择：

若血清、血浆、组织匀浆样本，用试剂盒中的标准品稀释液，梯度稀释标准品。

若细胞上清样本，建议用细胞培养基梯度稀释标准品。

(2)耗材准备：准备8个1.5Ml离心管，写上S1-S7、空白。

(3)梯度稀释：根据说明书，每管加入等体积的标准品稀释液（培养基）。吸取同体积溶解好的标准品到S1管中，吹打10次混匀，涡旋5S。从S1管中吸取同体积溶液到 S2管，吹打10次混匀，涡旋5s。同法稀释S3-S7浓度。

(4)空白： 标准品稀释液（培养基）作为空白即零浓度。

注意：梯度稀释标准品时，涡旋震荡混匀后可短暂离心，让到盖子、壁上的液体到管底，再开始稀释下个浓度。

标准品溶解、梯度稀释是ELISA实验关键点，按以上方法梯度稀释即可。

4.elisa 实验操作过程中有哪些注意事项

注意事项：

1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2.浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3.各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4.请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（*n*5）。

5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6.底物请避光保存。

7.严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。

8.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9.不同批号组分不得混用。

5.做elisa实验需要注意哪些问题?

Elisa实验中应该注意的问题，包括样品稀释、试剂盒平衡、样品和试剂的混匀、加样、温育等问题，希望对你有用处。

Elisa试剂盒有着准确性高、灵敏度高、特异性强的诸多优点，深受广大用户朋友的喜爱。然而，在实验过程中，也需要注意很多问题。对此，武汉福来生物工程提醒你，需要遵守一些规则，才能更好地进行实验，取得较好的实验成果。

Elisa方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。在Elisa测定中影响因素较多，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。引起ELISA测定错误结果的原因主要有：标本因素；试剂因素；操作因素。

1.样品稀释

一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。

2.试剂盒平衡

Elisa中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20~30分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。

3.样品和试剂的混匀

在稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。

4.加样

加样是一项很重要的步骤。加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。

5.温育

温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。

6.洗板

固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。

7.显色

显色一定要控制时间，根据试剂盒说明操作即可。一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。

8.比色

比色要注意波长的选择。以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。

6.ELISA实验操作中注意事项有哪些啊

1.储存。

收到试剂盒后应尽快放入冷藏室内保存，保存温度为4℃-8℃。2.回温。

试剂盒在使用前应于室温（22-27℃）下充分回温，回温时间为40-60分钟。回温过程中勿将酶标板的包装袋开封，回温结束后再将其从包装袋中取出使用。

3.样品稀释。样品稀释应严格按照说明书要求的稀释倍数进行稀释。

如稀释倍数过大，可采用多步法进行样品稀释。例如：试剂盒要求样品需进行500倍稀释，可吸取5μl样品加入245μl样品稀释液中，充分混匀后，再吸取10μl混合液加入90μl样品稀释液中即可。

4.加样。稀释好的样品在加入酶标板进行孵育的过程中，尽可能缩短第一次加样和最后一次加样的时间间隔，样品加好后马上开始计时。

5.洗板。样品孵育时间结束后，马上甩去孔内液体。

如多块酶标板需同时洗涤，可先将板内液体甩去，倒扣于吸水纸上，再依次进行洗涤。使用洗板机洗涤时，建议洗涤次数增加一次。

未用完的洗涤液可在4℃-8℃下密封保存1月。6.显色。

底物药片可在显色前3-5分钟加入底物缓冲液中，混合直到完全溶解。本试剂最好是现用现配，未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周。

7.终止及读数。提前打开酶标仪，加入终止液后立即读数。

8.同批号试剂盒中的试剂，除酶标二抗及阳性对照外，其余均可通用。9.移液器的正确使用、保存、清洁、校对。

10.实验室管理 桌面保持整洁，插枪头戴手套等。