蔗糖酶活力测定的(酶活力测定的注意事项有哪些)
1.酶活力测定的注意事项有哪些
注意事项：
1.底物浓度 除选择适合的底物外，在实际应用中更多考虑的是底物浓度。由于[S]与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。[S]范围一般选择在10~20Km为宜，此时反应速度基本达到最大反应速度，测定的误差在可接受范围。
2.酶浓度 在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说，只有[S]>>[E]时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。
3.温度 不同的酶最适温度可以不同，多数酶的最适温度在37~40℃，高于或低于最适温度，酶活性都降低。目前，酶活性的测定温度尚未统一，但常规实验室多使用37℃。温度对酶促反应的影响程度通常用温度系数（Q10）表示。温度系数指温度每升高10℃，化学反应速度增加的倍数。Q10通常为l~2。由温度系数得知，温度的变化对酶活性有着重要影响，因此要求酶活性测定要在恒温条件下进行，温度波动要控制在±1℃。
4.离子强度和pH值 在最适pH时，酶的活性最强，高于或低于最适pH，酶的活性都降低，多数酶的最适pH在5~8之间。在测定酶活性时，要求缓冲液具有足够的缓冲容量，以便使pH值保持稳定。血浆或血清标本含有多种缓冲溶质，具有较强的缓冲能力。为了防止血浆或血清标本缓冲溶质对反应液酸碱度的影响，使pH不致偏离设定值，标本用量不宜过大，血浆或血清标本体积/反应液体积≤1/10为宜。
5 辅助因子 某些金属离子和维生素类辅酶是结合酶的辅助因子，例如Zn2+是羧基肽酶的辅基，Mo6+是黄嘌呤氧化酶的辅基，NADH是不需氧脱氢酶的辅酶。这些酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性，因此在酶活性测定时，就要保证辅基或辅酶的供给。
6.激活剂 有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活剂，Cl-是淀粉酶的激活剂。因此在酶活性测定时，也要满足酶对激活剂的需要。
7.抑制剂 酶的抑制可分为不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。重金属离子和砷化物对巯基酶的抑制、有机磷对羟基酶的抑制属于不可逆抑制；丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制、磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的抑制属于竞争性抑制；哇巴因对Na+,K+-ATP酶的抑制属于非竞争性抑制。抑制剂使酶活性降低，在测定酶活性时，应避免抑制剂的影响。
综上所述，测定酶活性时，最适条件的选择应该遵循最适底物浓度、最适温度、最适pH值、满足辅助因子和激活剂、避免抑制剂的原则。
2.测定酶活性时应注意些什么?
酶的活性测定要求有适宜的特定反应条件，应注意影响酶促反应速度的各种因素应该相对恒定。
1.酶的样品应做适当的处理。2.反应体系中，底物的量足够使酶被底物饱和，以充分反映待测酶的活力。
但过高的底物浓度可能抑制酶的活性，一般底物浓度在10km以上。3.测定代谢物时应保持酶的足够浓度。
4.应根据反应时间选择反应的最适温度。5.根据不同的底物和缓冲液选择反应的最适pH。
6.为获取最高反应速度，在反应体系中应含有适宜的辅助因子，激活剂等。7.测定酶活性时应测定酶促反应的初速度。
3.用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响中水平实验结果是什么意思
需要，举例说明：正交实验法举例： 用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响 目的要求 1.初步掌握正交实验设计方法的使用 2.求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值 实验原理 酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如：底物浓度、酶浓度、溶液的pH值和离子浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响催化反应的速度。
通常是在其他因素恒定的条件下，通过对某因素在一系列变化条件下的酶活性测定，求得该因素对酶活力的影响，这是单因素的简单比较法。 本实验用正交法测定温度、pH值、底物浓度和酶浓度四种因素对蔗糖酶活性的影响，这是多因素（≥3）的实验方法。
正交法是通过正交表安排多因素实验，利用统计数学原理进行数据 分析的一种科学方法，它符合“以尽量少的试验，获得足够的、有效的信 息”的实验设计原则。正交试验法的程序为下列八个步骤： （1）确定试验目的。
实验目的是多种多样的，如找出产品质量指标的最佳组合、确定最佳工艺条件等。本实验的目的是为了提高酶的反应速度，提高酶的活力。
（2）选择质量特性指标。应选择能提高或改进的质量特性及因素效应。
对于本实验来说就是产物（葡萄糖）生成量的多少。 （3）选定相关因素。
即选择和确定可能对实验结果或质量特性值有影响的那些因素，可人为控制与调节的因素，如温度、pH等。这些因素之间有相互独立性。
（4）确定水平。水平，又称位级，是因素的一个给定值或一种特定的措施，或一种特定的状态。
水平也就是因素变化的各种状态。在确定水平时，应考虑选择范围、水平数和水平位置。
如本实验的温度水平可以选择20℃、30 ℃、50 ℃三个水平。 （5）选用正交表。
应从因素数、水平数以及有无重点因素需要强化考察等各方面综合考虑选用正交表。一般情况下，首先根据水平数选用2或3系列表，然后，以容纳试验因素数，选用实验次数最少的正交表。
如有重点考察的因素，则根据其多考察的水平数，选混合型正交表。 （6）配列因素水平，制定实验方案。
按随机原则，把因素配列于选用的正交表中，制定实验的顺序、时间等，即制定实验具体方案。 （7）实施实验方案。
按实验方案，认真、正确地试验，如实记录各种实验数据。 （8）实验结果分析。
对实验中取得的各种数据进行分析。如从数据中直接选出符合或接近质量特性期望值的实验条件组。
如不能采用直观分析方法，则应采用其他分析方法，确定各因素主次地位可用极差分析方法，定量分析各个因素对实验结果的影响程度，则用方差分析方法。 操作方法 1.实验设计： 1）确定指标：即实验的结果。
本实验的指标是酶活力。这里，用A520值表示。
2）制定因素水平表：考察四个因素（温度、pH值、底物浓度和酶浓度），每个因素取三个水平（如温度选择20℃、35 ℃ 和50 ℃ 三个水平）。水平是因素变化的范围（通常是根据专业知识确定。
如无资料可借鉴，应先加宽范围再逐步缩小）内要进行实验的具体条件，如表1。 表1 因素水平表 3）选择正交表：可容纳三因素三水平的正交表有L9(34)、L27(313)、L18(36*6)和L27(38*9)。
本实验不考察各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为3的的四个因素，故选用L9(34)表，见表2。 分析： A. 判断各因素的水平范围是否选偏； B. 判断各因素显著性大小的顺序； C. 判断实验结果的置信度。
实验安排 具体操作步骤： 1、将已配制好的三种不同pH的0.2mol/L的缓冲液于试管中。 2、将酶粉用蒸馏水溶解（适当体积10-30ml不等），离心去 除不溶物，10,000rpm/min,10min,4℃。
3、酶活预示实验，确定酶的稀释倍数。（可根据产物稀释的 倍数来确定酶的稀释倍数）A520在0.4-2.0之间即可。
4、准备10支试管。其中一支为“0”号管，作为测量时的参 比溶液。
其他九支试管根据前面的图表3加入相关的溶 液，分别在不同的条件下进行酶反应。利用二硝基水杨酸 的方法测定不同管在A520下的光密度值。
5、计算同一因素不同水平的级差，级差小代表离散度小， 表示该水平为酶反应的最适条件。 1）数据记录：将上述两组平行实验的结果取平均值后的9个数据，填入表4中的Yi项内。
2）数据整理及分析：对于一般的实验，可用极差分析，该分析方法简单、直观。对要求精细的实验，则要用方差分析，该方法可给出误差的大小估计，但有一定的计算量。
对于有混合水平的正交实验，只能用方差分析。
4.影响酶活性的因素实验应注意什么
(1)酶促反应过程中，只有最初一段时间内反应速度与酶浓度成正比，随着反应时间的延长，反应速度即逐渐降低。
(2)要规定一定的反应条件，如时间、温度、pH等，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定，如温度不得超过规定温度的士1℃，pH应恒定。
(3)配制的底物浓度应准确且足够大，底物液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止底物被分解。
(4)标本要新鲜，由于绝大多数酶可因久置而活力降低，标本如无法及时测定，应保存于冰箱中。用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。有些酶在血细胞、血小板中的浓度比血清高，为此在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。
(5)在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱、蛋白沉淀剂等。
