质粒常用的抽提方法(质粒抽提的抽提方法)

1.质粒抽提的抽提方法

质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。关于碱裂解法的原理，复旦大学生化与分子生物学实验室的网站有一篇专论，大家可以去看一下。这是一篇美文，非常有趣。文中提到了一个与几乎所有能查到的资料不同的观点，也是非常有启发的。

当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性；不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为不可逆的了 （电泳时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是此变性的质粒。）。所以，要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。 （似乎可以做这么一个推理：在碱性条件下，质粒的两条链从一点或者几个点开始分开，随着时间的延长，直到完全分开。理论上讲，完全分开的两条链要很快地配对复性，成功率肯定不可能是 100%的，而没有完全分开的两条链却完全可能 100% 配对复性。） 碱裂解法不适合大质粒的抽提，原因也是因为该方法太剧烈，使超螺旋比例较低。文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法，缺点是得率要低一些。现在得问题是，大质粒的拷贝数本来就低，如果抽提方法得率再不高的话，抽提起来就很费力了。如果注意到在碱裂解法中，超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入 NaOH/SDS 液后，溶液在 1 分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。这个实验我们没有做过，但 QIAGEN 抽提大质粒用的就是碱裂解法。

2.提取质粒有几种 方法

实验一

ApaLI (178)

P(BLA) ALPHA

质粒DNA的提取、质粒DNA的提取、酶切 DNA的提取 及琼脂糖凝胶电泳

ApaLI (2367)

EcoRI (397) AvaI (413)XmaI (413) SmaI (415)

APr

pUC19

BamHI (418) PstI (440)HindIII (448)

P(LAC) ORI

2686 bp

ApaLI (1121)

一 实验目的

掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点。 的基本原理和操作要点。 掌握碱裂解法分离质粒 的基本原理和操作要点 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 的试验方法 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 的方法和技术 学习琼脂糖凝胶电泳检测

二 实验原理

质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子， 质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染色体外小型（ 200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分 DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分 分子 DNAcccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 ），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。

培养细菌使质粒扩增 三个基本步骤 收集和裂解细菌 分离和纯化质粒DNA 分离和纯化质粒DNA

3.质粒DNA的提取方法总共有哪些,回答的全给高分

碱裂解法： 此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7、以10,000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于？0℃静置10min。 9、再以10,000rpm离心20min，弃上清。

10、用70%乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中 煮沸法 1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中， 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml）， 涡旋振荡3秒钟。 5、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。 7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。 酚氯仿裂解法 ① 从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中（含有卡那霉素30 μg/mL）摇菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 μL TE，充分混匀；加入400 μL酚氯仿（1∶1体积）混合液，剧烈振动10 s，混匀；12 000 g/min离心5 min,1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层；上清经国产0.22 μm针式滤器过滤1次；向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s,12 000 g/min离心5 min；沉淀溶于20 μL的RTE溶液中，37℃水浴. ② 按PstI内切酶说明书进行酶切反应（37℃，1 h）. 酶切产物10 μL,10 g/L琼脂糖凝胶电泳. ③ PCR引物根据参考文献〔1〕设计，预计扩增产物片断大小为714 bp. ④ 常规制备感受态菌E.coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素（30 μ/mL）LB培养平板中，37℃培养，15 h后观察筛选克隆情况. 碱解法 操作步骤 1、细菌繁殖 LB培养基，2 ml/20ml,37℃，200rpm，摇一摇，过夜 2、离心10 min,5000 rpm, 4℃；弃上淸液 3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min,5000 rpm, 4℃ 加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min 4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min 5、加入1.2 ml Solution II， 冰浴，5 min 6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min,12000 rpm, 4℃ 7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min 8、离心10 min,12000 rpm, 4℃ 9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中 10、加入40 ul,3 M NaAc 11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀 12、离心10 min,12000 rpm, 4℃ 13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。

14、电泳检测提取DNA的质量 还有碱变性法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。

4.质粒提取的主要步骤是什么及其作用

从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。

当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。

在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA(Open circularDNA，简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(LinearDNA)。

当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

5.农杆菌质粒DNA常用的提取方法

一、从在含20 mg/l Kanamycin和15 mg/l Gentamycin 5-8 ml的液体LB培养基中接种Agrobacterium细胞，然后在28℃、200-220 rpm培养24 h。

然后进行质粒提取。 二、新鲜配制Sol II溶液（880 l H2O, 100 l SDS 10%, 20 l 10 N NaOH），及包含 4 mg/ml溶菌酶Lysozyme 的200 l Sol I (P1)溶液。

三、对培养一昼夜的的Falcon试管在3600 rpm速度下进行离心12 min，丢弃上清。 四、用200 l 5 M NaCl重悬农杆菌细胞，利用涡旋将农杆菌细胞混匀。

转移到Eppendorf管中。 生物帮有相关问题的详细介绍，分子生物学洗涤剂 /101184/。

6.质粒DNA的大量提取和纯化有哪些步骤

大提质粒和小提质粒的基本原理是一样的，都是通过一定的方法（如加碱裂解）使在细菌内大量扩增的质粒释放出来，然后经过去蛋白去RNA等一系列步骤纯化DNA，最终将DNA提取出来。区别：

1.大提用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。

2.一般试剂盒中大提比小提多了溶菌酶、异丙醇（回收沉淀核酸）、含一定量PEG的氯化物（回收质粒DNA）及乙酸铵等，其作用及目的都是有利于细菌的裂解和质粒的纯化，所以大提的产物比小提的量多很多，而且纯度很高。

3.小提一般用于质粒鉴定和对纯度要求不是很高的实验，大提用于质粒的大量提取和转染等纯度要求很高的实验。