线粒体分离的(提取线粒体 及其叶绿体的注意事项)
1.提取线粒体、及其叶绿体的注意事项
原理：分离要用的主要试剂是层析液。
层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂。叶绿体中的色素在层析液中的溶解度不同：溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快；溶解度低的随层析液在滤纸上扩散得慢。
层析分离叶绿体中的色素：将纸条画有滤液细线的一端置于烧杯中的层析液中，注意千万不要将滤液细线浸没在层析液中，否则会使色素溶解而导致试验失败。层析液是挥发性较强的有机溶剂，并且具有一定的毒性，所以在操作中要尽量用培养皿盖住烧杯口。
观察实验结果：最后滤纸条上将分离出四条色素带，颜色从上往下分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色，四种色素分别是胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b。 ############################################################# 注意事项：1.减去角：为了尽量让层析液在滤纸上的扩散速度相等2.加入二氧化硅：为了研磨的充分，加碳酸钙是为了防止研磨时色素被破坏，加入丙烯来溶解色素。
3.加入酒精：因为叶绿素溶于有机溶剂，所以要加酒精，就是用来溶解的啊！！4.加入CaCo3：为了保护叶绿素分子不受损伤.叶绿素不稳定的，容易被活细胞里的有机酸破坏（老师教我们记这点的时候说：你们给我记住了！！"盖世太保"（"钙是太保"）保护叶绿素啊..汗汗。
） Principle:Separation of the main reagent is to use liquid chromatography. Liquid chromatography is a kind of fat-soluble strong organic solvent. The chloroplasts pigment in liquid chromatography the solubility of different: high solubility with liquid chromatography in the filter paper spread fast; Low solubility with liquid chromatography in the filter paper spread slowly.Chromatography separation in the chloroplasts pigment: will note the picture has filtrate fine line end in beaker of chromatography liquid, pay attention to don't will filtrate fine wire submerged in liquid chromatography, or you will make pigment solution and lead to test failure. Liquid chromatography is volatile strong organic solvents, and has certain toxicity, so in the operation to try to use petri dish cover glass mouth.To observe the experimental results: the article filter paper will separate the four pigment belt, color from up to down respectively is orange, yellow, turquoise and kelly, four kinds of pigment were carotene, lutein, chlorophyll a and chlorophyll b.# # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # Note:1. Minus the Angle:In order to try to get chromatography liquid in the filter paper on the diffusion velocity equal2. Add silica:In order to fully grinding, add calcium carbonate is to prevent the grinding pigment is destroyed, join propylene to dissolve the pigment.3. Add alcohol:Because the chlorophyll soluble in organic solvents, so want to add alcohol, is used to dissolve!!4. Join CaCo3:In order to protect the chlorophyll molecule is not damaged.Chlorophyll is not stable, easy to live in the cells of organic acid damage(the teacher taught us to remember this: you give me remember!! "gestapo" (" calcium is boyz ") to protect the chlorophyll ah.. sweat | | | sweat。
2.如何分离细胞核与线粒体
如何分离细胞核与线粒体
细胞核与线粒体的分级分离
一、原理
细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆（Homogenization）低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质（即0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙）进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离（Fractionation）由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
二、细胞核的分离提取
（一）操作步骤
1.用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块（去除结缔组织）尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
2.将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。
3.剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3~5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。
4.将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；（1）缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；（2）同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；（3）余下的沉淀物进行下一步骤。
5.用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。
6.将①、②、③涂片用l%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。
（二）结果
分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。
三、高速离心分离提取线粒体
（一）操作步骤
1.将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。
2.加入0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液混匀成悬液（可用牙签）。
3.取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上（分别标记④、⑤涂片），各滴一滴0.02%詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。
（二）结果
油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。
3.分离线粒体的时候为什么要先加少许的介质液
由于不同细胞器的密度不同，因此可以用差速离心法将不同细胞器进行分离；线粒体进行有氧呼吸的第二、第三阶段，在线粒体中进行反应的物质的丙酮酸，条件是由氧气存在，且温度、PH等条件适宜；线粒体内膜向内凹陷形成嵴进而增大膜面积，因此将线粒体放入蒸馏水中线粒体会通过渗透作用吸水，由于线粒体内膜有很多嵴，吸水后不易破裂，而外膜吸水膨胀，容易破裂，进而将线粒体内膜与外膜分开.
故答案为：
差速离心 丙酮酸 有氧气存在、适宜温度 蒸馏水（或低渗溶液） 线粒体会吸水膨胀，线粒体内膜有很多嵴，吸水后不易破裂，而外膜吸水膨胀，容易破裂
