大肠杆菌菌种的制备(大肠杆菌感受态细胞的制备要注意哪些因素)
1.大肠杆菌感受态细胞的制备要注意哪些因素
(1)质粒DNA的质量和浓度： 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。
一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%,1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。
此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。 （2）感受态细胞的质量： 所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃ （3）细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5*107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0.5时，细胞密度在5*107个/ml左右。
（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
（二）感受态细胞转化中的影响： 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
2.感受态细胞的制备时有什么注意事项
方法一：细菌转化的方法多以Mendel和Higa(1970)的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。
用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。
操作过程简述如下。1.从37℃培养16~20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的16~20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养约2~3h（旋转摇床200~300r/min），每隔20~30min测量OD600值≈0.4。2.在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10~20min。
3.于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。4.倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
5.以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。6.于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。
7.倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。8.每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1MCaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。
9.用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl,DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。10.将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s~2min，不要摇动试管。
11.快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2min。12.每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
13.将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/lMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。14.将平板置于室温至液体被吸收。
15.倒置平皿，于37℃培养，12~16h后可出现菌落。方法二：CASsuperOne-采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。
与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃，无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。准备工作：1.从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37度过夜至长出单菌落。
挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5mlLB培养基中，37℃，250rpm，过夜培养。2.次日从5mlLB培养物吸取200μl转入50mlLB培养基中（250ml锥形瓶），37℃，250rpm培养2小时，此时OD600约0.4—0.5。
感受态细胞的制备：3.吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。4.加入100μl预冷的SolutionA，悬浮菌体，冰浴30分钟。
5.此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。细胞转化：6.在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA，混匀，冰浴30分钟，然后42℃1分钟热击，再次冰浴2分钟。
加入0.9mlLB培养基，20μlSolutionB,37℃，振荡培养1小时。7.取适当菌液（100-200μl）涂布相应抗性的平板。
8.过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。补充说明：1.所用器具一定要清洁；2.操作步骤2中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml锥形瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基；3.在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2，效果会更好一些；4.为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要高于0.6;5.制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作；6.细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB，简化操作步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。
方法三：1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜2、取0.1ml过夜培养物转种于含10mlLB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0.3ml离心管中，冰浴10min。4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1MCaCl2溶液中，置冰上30min6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去上清液7、将菌体悬浮于0.1mlCaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。
方法四：（1）将1ml过夜培养的细菌（如DH52、TG1、TM101）接种于100ml2*YT培养于500ml烧瓶。于37℃刷烈振荡，通常≥200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2~0.5(5*107cells/ml)，需2~4h。
(2)将培养物放于冰上致冷10min，于4℃离心细菌培养物，10000rpm离心10min。(3)弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半（约50ml）的50mMCaCl2和10mmTris·HCl(pH8.0)无菌冷冻液体中。
（4）将细菌悬浮放在冰上约5min，然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。(5)弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl(pH8.0)无菌冷冻中。
此时的细。
3.大肠杆菌发酵的实验步骤 详细点(比如操作过程中的注意事项) 谢谢
1、种子接种：将冻干管或甘油管种子接种到LB培养基摇瓶中进行活化，一般可以加抗性标记对应的抗生素。然后摇床恒温培养。
2、发酵培养基准备：摇瓶的话好说，灭菌锅就行。发酵罐的话，要先将罐子清洗干净，然后配料，然后灭菌。
3、将培养好的种子液，按一定的接种量接到发酵培养基中。如果是摇瓶发酵的话一般不用中控，时间到了放瓶即可。如果是发酵罐发酵的话，中间过程需要补料、调节PH值、控制好溶氧转速等等。要注意取样时样液的密封性，如果样液到处乱撒，容易导致噬菌体污染。
4、不论是产酶、蛋白、氨基酸还是别的什么，产物量都是必须检测的哦。
5、放罐后，也要注意料液的收集、使用和灭活，严防噬菌体污染。
4.大肠杆菌菌种液的配制具体步骤
复苏：
配制LB固体培养基，高压蒸汽灭菌，倒平板。
挑取菌种，在培养基上划线。
37℃培养24h至长出菌落。
摇菌
配制LB液体培养基。高压蒸汽灭菌。
无菌试管内加入3ml LB培养基，挑取单菌落加入培养基中，37℃，200rpm摇菌过夜。
扩大培养：
配制LB液体培养基。高压蒸汽灭菌。
三角瓶中加入50ml液体LB培养基，加入1ml菌液，37℃，200rpm摇菌至所需OD值。
注：培养基内需加入菌株所具有抗性的抗生素。
工具：超净工作台、酒精灯、接种针、试管、高压灭菌锅、培养皿等。
注意无菌操作。
