倾注培养基的(培养基的配置应该注意哪几大步骤?)
1.培养基的配置应该注意哪几大步骤?
楼主你好： 培养基是微生物测定的基础，培养基的质量因而成了保证微生物实验成功的关键。
培养基的制备、合理的贮存、培养基的质量检验，能确保提供持续高质量的培养基。在按照可接受的来源和标准中的配方制备培养基的过程中，重要的是选择正确的培养基和成分。
与脱水和制备好的培养基一起的还常常伴有供应商的配方和说明。 微生物实验中培养基的配置应该注意的几大步骤： 1、常用玻璃仪器的准备制备培养基所用的吸管、锥形瓶、毛细吸管、平皿等玻璃仪器用前要用肥皂水洗刷后用清水冲洗干净，晾干后备用。
（1）平皿用纸或布包好，或装在金属盒内，于121℃高压蒸汽菌3min后烘干，备用。 （2）试管管口用棉花塞或硅氟塑料试管塞塞好，再用布或报纸包扎好，121℃高压蒸汽灭菌20℃后烘干，备用。
（3）吸管及滴管先用少许棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽内的气体污染），然后用纸包后或装入金属吸管筒内，于121℃高压蒸汽灭菌20min后烘干，备用。其他玻璃器皿均应按上法处理，也应装金属筒内160℃干热灭菌2h后，备用。
2、培养基的制备及储存 （1）溶化：一般应放在玻璃器皿或搪瓷齐内。加入蒸馏水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分。
在使用干燥培养基时，先将蒸馏水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置10—15min，搅拌，振荡，或延长时间以促进溶解，一般不要热，必要时加热，但时间不宜过长，温度不宜过高，避免某些营养成分被破坏。 （2）校正酸碱度（调节pH）：培养基必须有适当的pH。
因此测定pH是培养基配制过程中的重要步骤之一，测定pH的标准温度为25士2℃。调节pH可用无菌的1mol/l氢氧化钠溶液或10%碳酸钠溶液、1mol/l盐酸溶液。
当调节缓冲液的pH时，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氢氧化钾溶液。灭菌后的pH会比灭菌前的pH升高或降低，一般高压灭菌前培养基的pH会比最终pH调高0.2左右，灭菌后基本合适。
因此对培养基、缓冲液、试剂在灭菌前后的pH均进行测定，并记下每次pH的测定结果，有助于积累数据考察每种培养基、缓冲液、试剂对灭菌程序的耐受性，从而指导灭菌前pH的调节。干燥培养基一般已校正过pH，用时也必须再验证。
测定时，一般用指示剂滴入培养基观察其颜色的变化，或用pH计校正，如与所需pH不符，可用以上的酸或碱液加以校正。调整pH后要加热过滤，使培养基澄清。
（ 更多质量检测、分析测试、化学计量、标准物质相关技术资料请参考中国标准物质 ） (3)培养基的分装：大批量配制时使用的自动分配器须经校准和确认。每次使用前后，均要对分配器的管道系统进行冲洗，在分装无菌培养基前，则要采用无菌硅胶管。
固体培养基一般分装在250ml、500ml锥形瓶中，高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。 平皿：倾注平皿，应在无菌室中放置3—4h，如用塑料平皿须在35℃培养箱 中倒置30—60min。
让水蒸汽自然蒸发。 斜面：制备低层斜面分装于试管，约占容积1/5，灭菌后趁热斜放在细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装使注意管口和瓶塞上勿沾有培养基，如沾有培养基应用布抹去，以避免污染。
高层斜面：制备高层斜面分装于试管，约占试管容积的1/3，灭菌后趁热放置成高层短斜面，待其凝固后应用。 分装好的培养基或缓冲液等及时密封后必须在配制当天（2h内最佳）进行灭菌处理。
液体、半固体培养基一般在高压灭前分装，约装试管容积的1/3，在灭菌后还要加其他成分的液体、半固体培养基，灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。 培养基的灭菌：培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基的灭菌时间和压力，按其成分不同而定。
普通培养基采用121℃、103.42kPa灭菌15min，但容器和装量较大时，应延长至20min。含糖培养基115℃、68.85kPa灭菌30min。
含糖、血清、鸡蛋等培养基可用流动蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，连续3d，间歇灭菌。血清或组织液，采用低热56—58水浴1h，连续5—6d灭菌，一些遇高温即被破坏的物质如尿素、腹水等，可用细菌过滤器，过滤除菌。
高压灭菌应严格按照操作规程执行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内的空气，再逐渐升压保持预定的压力和时间，达到全部杀灭微生物。以上的灭菌时间和温度要经过验证确认，如不同类型培养基混合一起灭菌时宜采用115℃、68.85kPa灭菌30min为好。
通过无菌技术为测试制备的每一批培养基其PH在放冷至室温（25°）后，都应测定。一个扁平的pH计用于培养基表面pH值的测定，浸入式的pH计用于液体的测定。
各供应商提供的培养基的pH应该在规定的±0.2的范围内，除非通过验证得到更宽的范围。
2.配制培养基应注意哪些问题
1、培养基配方的选定
同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。
2、培养基的制备记录
每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。
3、培养基成分的称取
培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方面军做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。
4、培养基各成份的混合和溶化
培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢莴加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。
5、培养基pH的初步调正
因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终PH，保证培养基的质量。PH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。
6、培养基的过滤澄清
液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此 ，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。
琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷却至55~60°C的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入1~2个鸡蛋的蛋白，强力振摇3~5分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121°C加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。
7、培养基的分装
培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎（现试管一般多有用螺旋盖者）。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终pH之用。
8、培养基的灭菌
一般培养基可采用121°C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。
某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50°C左右的培养基中。
琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55℃-60℃时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。
9、培养基的质量测试
每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。
将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。
用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24~48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。
10、培养基的保存
培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。
3.培养基在使用过程中应注意哪些问题
1.购置培养基时要求供应商提供产品质控证书。
使用前首先对外观、批号、pH 值、灭菌要求、选择性等进行初步评估，。2.培养基的使用应在有效期内，不同批号的培养基不要混合使用。
干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；未开瓶的培养基在室温下的最长保存2年，开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在6个月内用完。应定期对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。
3.培养基的配制：使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢锅加热溶化.也可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。
容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基。为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热。
在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动，以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化.迄至煮沸。
在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。4.培养基的灭菌一般培养基可采用121℃ 高压蒸汽灭菌15分钟的方法。
在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类，应另行配成20% 如或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。
明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应从无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50℃ 左右的培养基中。
琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出、待冷至55-60℃时，摆置成适当斜面、待其自然凝固。已配制好的培养基必须及时灭菌（在2小时内），避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。
高温可破坏培养基的营养成分，还会使琼脂的凝胶强度下降，因此必须严格控制灭菌温度和时间，并且不可重复灭菌。5 培养基的性能测试5.1 外观 控制制备好的培养基应有相应的颜色，一般的培养基应澄清、无浑浊、无沉淀。
使用前应检查培养基的颜色是否发生变化，是否蒸发/脱水。 5.2pH测定 微生物必须在适宜的pH范围内才能正常生长繁殖或体现其生物特性。
培养基配方要求的pH为灭菌或消毒后的pH 值，即培养基使用前的pH，并应在25℃温度下采用精密酸度计进行测量，固体琼脂培养基应以特殊的胶体表面测量电极进行测量。使用过程中，如果需要调整培养基的pH，应用1mol/L Na0H或 lmol/LHCL调整，注意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。
5.3 污染控制 从每批制备好的培养基中选取部分进行污染测试（无菌试验），确定无微生物生长方可使用。5.3 性能测试 可按2010版药典附录微生物限度检查法及无菌检查法中的规定进行适用性检查。
（对微生物限度检查法中用到的培养基的适用性检查，在2010版中国药品检验标准操作规程：微生物限度检查法章节中对实验操作有详细说明。）6.培养基的保存灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。
所配制的培养基的量，应该是在最长保存期限内正好使用完（2-25℃避光的环境，若保存于非密封容器，3周内使用，密闭容器可使用一年----2010版药典规定。）含染料的培养基应闭光保存；倒好的琼脂平板如果配制的当天未使用完，应于冷藏保存，如果保存时间超过2天，应将其放入密封的塑料袋中保存；配好的肉汤类培养基如果保存时间超过2个星期，应将其放在带有螺旋盖的试管或其它密闭的试管或容器中防止蒸发。
4.微生物实验中培养基的配置应该注意什么
1、常用玻璃仪器的准备 制备培养基所用的吸管、锥形瓶、毛细吸管、平皿等玻璃仪器用前要用肥皂水洗刷后用清水冲洗干净，晾干后备用。
（1）平皿用纸或布包好，或装在金属盒内，于121℃高压蒸汽菌3min后烘干，备用。 （2）试管管口用棉花塞或硅氟塑料试管塞塞好，再用布或报纸包扎好，121℃高压蒸汽灭菌20℃后烘干，备用。
（3）吸管及滴管先用少许棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽内的气体污染），然后用纸包后或装入金属吸管筒内，于121℃高压蒸汽灭菌20min后烘干，备用。其他玻璃器皿均应按上法处理，也应装金属筒内160℃干热灭菌2h后，备用。
2、培养基的制备及储存 （1）溶化：一般应放在玻璃器皿或搪瓷齐内。加入蒸馏水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分。
在使用干燥培养基时，先将蒸馏水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置10—15min，搅拌，振荡，或延长时间以促进溶解，一般不要热，必要时加热，但时间不宜过长，温度不宜过高，避免某些营养成分被破坏。 （2）校正酸碱度（调节pH）：培养基必须有适当的pH。
因此测定pH是培养基配制过程中的重要步骤之一，测定pH的标准温度为25士2℃。调节pH可用无菌的1mol/l氢氧化钠溶液或10%碳酸钠溶液、1mol/l盐酸溶液。
当调节缓冲液的pH时，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氢氧化钾溶液。灭菌后的pH会比灭菌前的pH升高或降低，一般高压灭菌前培养基的pH会比最终pH调高0.2左右，灭菌后基本合适。
因此对培养基、缓冲液、试剂在灭菌前后的pH均进行测定，并记下每次pH的测定结果，有助于积累数据考察每种培养基、缓冲液、试剂对灭菌程序的耐受性，从而指导灭菌前pH的调节。干燥培养基一般已校正过pH，用时也必须再验证。
测定时，一般用指示剂滴入培养基观察其颜色的变化，或用pH计校正，如与所需pH不符，可用以上的酸或碱液加以校正。调整pH后要加热过滤，使培养基澄清。
（3）培养基的分装：大批量配制时使用的自动分配器须经校准和确认。每次使用前后，均要对分配器的管道系统进行冲洗，在分装无菌培养基前，则要采用无菌硅胶管。
固体培养基一般分装在250ml、500ml锥形瓶中，高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。 平皿：倾注平皿，应在无菌室中放置3—4h，如用塑料平皿须在35℃培养箱 中倒置30—60min。
让水蒸汽自然蒸发。 斜面：制备低层斜面分装于试管，约占容积1/5，灭菌后趁热斜放在细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装使注意管口和瓶塞上勿沾有培养基，如沾有培养基应用布抹去，以避免污染。
高层斜面：制备高层斜面分装于试管，约占试管容积的1/3，灭菌后趁热放置成高层短斜面，待其凝固后应用。 分装好的培养基或缓冲液等及时密封后必须在配制当天（2h内最佳）进行灭菌处理。
液体、半固体培养基一般在高压灭前分装，约装试管容积的1/3，在灭菌后还要加其他成分的液体、半固体培养基，灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。 培养基的灭菌：培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基的灭菌时间和压力，按其成分不同而定。
普通培养基采用121℃、103.42kPa灭菌15min，但容器和装量较大时，应延长至20min。含糖培养基115℃、68.85kPa灭菌30min。
含糖、血清、鸡蛋等培养基可用流动蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，连续3d，间歇灭菌。血清或组织液，采用低热56—58水浴1h，连续5—6d灭菌，一些遇高温即被破坏的物质如尿素、腹水等，可用细菌过滤器，过滤除菌。
高压灭菌应严格按照操作规程执行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内的空气，再逐渐升压保持预定的压力和时间，达到全部杀灭微生物。以上的灭菌时间和温度要经过验证确认，如不同类型培养基混合一起灭菌时宜采用115℃、68.85kPa灭菌30min为好。
