目视比色法(比色法操作的注意事项是什么?)

1.比色法操作的注意事项是什么?

噻唑蓝（MTT）比色法操作注意事项

噻唑蓝（MTT）：四唑盐

1. 原理：

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法.活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与活细胞数成正比。

2. 优点：简单快速、灵敏、经济

3. 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

4. 应用：新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等

5. MTT主要有两个用途

1）药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；

2） 细胞增殖及细胞活性测定。

6. 比色法操作注意事项

1） 选择适当的细胞接种浓度，保证细胞培养结束时浓度不至于过满。

2） 种板技术：均匀。

3） 实验时应设置调零孔，溶媒孔，加药孔。

调零孔：培养基、MTT、DMSO。（无细胞）

溶媒孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、溶酶。

加药孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、不同浓度的药物。

（一般5-7个梯度，设3-5个复孔）

4）避免血清干扰：一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。

5）边缘效应：周边孔加入PBS。

6)MTT的配置： MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液。4℃下避光保存2周。

7）孔板的重复利用（1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心最好让洗衣粉先化开）。2.用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾

干.3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液（六小时以上即可）后自来水洗净（20次左右）每个孔都要处理4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3

遍，烤干5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。或泡酸过夜，dd水冲洗干净，烘干或者晾干后紫外照射30min以上即可使用。

8)MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

9）在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

10)MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套。

11）配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以操作台上的照明灯关掉。

2.目视比浊法

方法提要

浊度与透视度呈反比关系，水样与标准系列进行透视度比测，定值。本方法规定1000mL纯水中含高岭土1mg的浊度为1°。

本法适用于近海海域和大洋水浊度的测定。3个实验室分析了用无浊纯水配制水样，浓度分别为7.0mg/L和50.0mg/L，测试结果重复性相对标准偏差为3.78%，相对误差为4.10%。

试剂

无浊纯水取蒸馏水或去离子水，通过0.2μm滤膜抽滤，贮存于聚乙烯桶中，用过滤水淋洗聚乙烯桶2次，弃去初滤水200mL，最好当天制备。

滤膜（0.2μm）。

二氯化汞溶液（50g/L）（注意：二氯化汞剧毒，小心操作！）。

焦磷酸钠溶液（50g/L）。

高岭土（机选特号）。

浊度标准储备溶液将高岭土置于（105±1）℃烘箱中烘干2h，移入盛有硅胶的干燥器中，冷却30min。称取3~5g高岭土，置于玛瑙研钵中加少量水调成稀糊状，研磨约50min，全部转移入1000mL量筒中，补加纯水到1000mL标线处，充分搅拌均匀后，在（20±0.5）℃下静置24h。用虹吸法吸取上层800mL悬浊液移入第2个1000mL量筒中，补加无浊纯水到1000mL标线处，充分搅匀后，再次置于（20±0.5）℃下静放24h。用虹吸法吸除上层液800mL，留取底层200mL悬浊液并加纯水到1000mL标线，然后盛于1000mL棕色试剂瓶中，塞严保存。

浊度标准储备溶液浊度的标定量取50.0mL标准储备溶液于恒量（m1）的蒸发皿中，置于水浴锅上蒸干，移于105℃干燥箱中烘2h。置于硅胶干燥器中冷却30min，称量（m2）。重复烘干、冷却、称量步骤，直到两次质量差小于0.2mg。按下式计算浊度标准储备溶液中高岭土的质量浓度：

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中：ρ高岭土为浊度标准储备溶液中高岭土的质量浓度，mg/mL;V为量取浊度标准储备溶液的体积，50.0mL;m1为蒸发皿的质量，g;m2为蒸发皿加烘干后高岭土的质量，g。

此浊度标准储备溶液浊度=ρ高岭土*1000。

浊度标准中间溶液准确量取一定体积含有250mg高岭土的标准储备溶液置于1000mL容量瓶中，加入1.0g二氯化汞（HgCl2）；溶解后，补加无浊纯水至标线，充分混匀，转入具橡皮塞的棕色试剂瓶中。此标准中间溶液浓度为0.25mg/mL。浊度为250°。

浊度标准溶液移取40.0mL浊度标准中间溶液置于100mL容量瓶中，加入0.50mL焦磷酸钠溶液，加无浊纯水至标线，混匀。此液浊度为100°。

校准曲线取12支100mL具塞比色管，分别加入0mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL、8.00mL、9.00mL、10.0mL浊度标准溶液，再加入50.0mL二氯化汞溶液，然后再加无浊纯水至标线，混匀。此系列浊度分别为0°、0.50°、1.00°、2.00°、3.00°、4.00°、5.00°、6.00°、7.00°、8.00°、9.00°、10.0°。

分析步骤

将混匀的水样，倾入具塞比色管中至标线，立即同标准系列比较定量。水样浊度为0°~10°范围的测定，用黑色背景，垂直目视比较而定；10°以上的测定用黄色方格坐标纸为背景，水平透视方格线条的清晰程度而定量。然后将测定值记入浑浊度记录表，取两位有效读数；若水样浊度超过100°，则需用无浊纯水稀释水样至可测范围，将测定值乘以稀释倍数，即为原水样浊度。

注意事项

1）每次量取水样或标准液时，必须将水样瓶横放，上下强烈振荡30次后，立即取出水样。

2）玻璃试剂瓶磨口与磨口塞之间，在启瓶对磨中，可增大所盛液体的浊度。因此所用水样瓶及试剂瓶，均应配换橡胶塞，并将胶塞置于盛纯水的烧杯中煮沸2h。

3）水样中具有迅速下沉的碎屑及粗大沉淀物都可被测定为浊度。不洁净的玻璃器皿和空气泡，以及扰乱水样表面能见度的振动都能造成虚假结果。

4）水样保存，在取样当天测定浊度。如果不可避免要保持更长时间，将水样保存暗处可达24h。如若在样品中加HgCl2固定剂，可保存22d。

5）除非另作说明，本法中所用试剂均为分析纯，水为无浊水或等效纯水。

3.比色法操作的注意事项是什么?

1选择合适的熔样方法，制备合适的试样溶液（1）氢氧化钠为熔剂，盐酸分解；（2）碳酸钠烧结，盐酸分解或碳酸钠烧结，氯化铵重量法测定纯SiO。

时的滤液，以及纯SiO。残渣经焦硫酸钾熔融后分解溶液，二者合并；（3）碳酸钠一硼砂为混合熔剂，稀硝酸和稀硫酸溶解后之滤液，或者稀硝酸溶解液，或浓盐酸分解。

2显色反应（1）掩蔽剂与显色剂应有正确的配制和保存方法，否则影响吸光度。（2）显色温度与时间。

显色反应有一定的温度和时间要求，如高碘酸钾氧化比色法分析MnO，应微沸10~15min使显色完全，并冷却至室温下比色。二安替比林甲烷比色法分析TiO。

由于显色反应较慢，显色时间则需较长时间（40min以上）。（3）比色。

比色仪器分光光度计应定期检定，应选择正确的波长，合适光程的比色皿。色皿应保持干净，受污染的比色皿可用稀硝酸浸洗，用镜头纸擦拭表面，比色皿内液体不能有气泡或悬浮物。

通常情况下，比色测定在室温进行。

4.什么叫比色法?操作上应该注意什么问题?

定义 以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。

比色法作为一种定量分析的方法，开始于19世纪30~40年代。比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。

选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。 常用方法 常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律[1](A=εbc)为基础。

常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。

光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。

但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能 得到一定波长范围的复合光 ， 而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。20 世纪30~60年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。

比色法在无机材料分析中的应用及注意事项： 1比色法的应用比色法是利用溶液颜色的深浅来确定待测物质含量的一种方法.在无机材料低含量成分分析中，与常用的滴定法、重量法比较，比色法具有较高的准确度和灵敏度.例如，TiO2滴定法，存在操作麻烦、终点颜色难以辨认的缺点.矾土、普通矿渣、铁矿石中的TiO2、MnO，粘土、水泥中的TiO2，石灰石中的SiO2、Al2O3、Fe2O3，硅砂中的Fe2O3等等，这些成份含量低，一般在5%以下，若采用滴定法分析，0.05ml的滴定量就造成较大的误差，甚至未能检测出结果.特别是硅质玻璃原料硅砂中的Fe2O3，微量Fe2O3直接影响其产品质量的评级，因此不能采用滴定法，而应采用比色法进行分析（见JC/T753-2001硅质玻璃原料化学分析方法）.比色法是无机材料化学成分分析的常用方法之一，TiO2、MnO、Al2O3、Fe2O3、SiO2等低含量成份，采用比色法可获得较高的准确度，从而能更好地指导生产.。

5.目视观察法注意的事项有哪些

(1)试样的控制，试样受检面必须保持完整，不允许有擦花或划伤等破坏，而且受检面必须清洁，不允许有污渍、油污等脏物覆盖在受检面上，因此测试前一般要用不破坏氧化膜的有机溶剂轻轻擦拭试样表面； （2）试验溶液浓度的控制，氢氧化钠溶液的浓度必须严格控制到100g/L，浓度偏低或偏高将直接导致测试结果偏大或偏小； （3）试验温度的控制，试验时不仅要保证试验环境温度控制在35℃±1℃，而且试验溶液和试样也必须控制在35℃±1℃，为此在测试前应先将试液和试样放置于恒温仪器中保持一段时间，只有当试液和试样恒定在35℃±1℃之后才可以进行测试。

6.目视观察法的注意事项有哪些

对于滴碱试验考虑的关键是，试验温度的控制以及如何准确地判断氧化膜刚好被穿透的时间。

我国GB/T5237。2-2000中对滴碱试验方法规定为：“在35℃±1℃下，将大约10mg、100g/LNaOH溶液滴至型材试样的表面，目视观察液滴处直至产生腐蚀冒泡，计算其氧化膜被穿透的时间。

也可用仪器测量氧化膜穿透的时间。”也就是说，国标认可了两种滴碱试验方法，即目视观察法和仪器测量法。

对于目试验观察法，国标描述的比较简单，试验操作中的一些注意事项及其影响因素未作描述。而为了保证测试结果的准确性，在操作过程中对于影响因素应加以注意，以便尽可能减少或避免这些因素的影响，本方法应注意的事项主要有以下几点： （1）试样的控制，试样受检面必须保持完整，不允许有擦花或划伤等破坏，而且受检面必须清洁，不允许有污渍、油污等脏物覆盖在受检面上，因此测试前一般要用不破坏氧化膜的有机溶剂轻轻擦拭试样表面； （2）试验溶液浓度的控制，氢氧化钠溶液的浓度必须严格控制到100g/L，浓度偏低或偏高将直接导致测试结果偏大或偏小； （3）试验温度的控制，试验时不仅要保证试验环境温度控制在35℃±1℃，而且试验溶液和试样也必须控制在35℃±1℃，为此在测试前应先将试液和试样放置于恒温仪器中保持一段时间，只有当试液和试样恒定在35℃±1℃之后才可以进行测试；其四是恒温仪器的选用，恒温仪器的选用在本方法中是一个非常重要的环节，因为所选用的恒温仪器不仅应起到恒温的作用，还必须考虑要便于观察仪器内试样的变化情况，如果所选用的恒温仪器没有一个能够清晰地观察仪器内试样变化情况的观察口，那么要想准确地判断出试样何时开始腐蚀冒泡是不大可能的。

另外，目视观察法还受试验人员经验的影响，在实际检验工作中发现，从阳极氧化膜开始溶解到氧化膜被穿透（试样开始腐蚀冒泡）这一过程中并没有一个很明显的变化，给氧化膜穿透时间的判断带来很大难度，这就对试验人员提出了很高的要求，试验人员必须要有非常丰富的实践经验，能够准确地判断出氧化膜何时被穿透而开始腐蚀冒泡。

7.如何用目视比色法快速测试果园土壤和果树植株氮磷钾速效养分

第一步：果园土壤和果树植物供试液的制备。

土壤中易被作物吸收利用的养分称为土壤速效养分，这些养 分主要存在于土壤溶液和土壤胶体上，用适当的酸、碱或盐类的 溶液处理土壤，可将它们溶解和代换出来i①测定土壤硝态氮、铵态氮和速效钾供试液的制备（此为供 试液I）。 称取相当于2克干土的湿土，放入干净的小浸提杯中，用量筒加入0。

5摩尔/升硫酸钠（Na2S04• 10H2O）溶液10毫 升，盖好杯子，用力上下摇动300次后，打开杯盖，将折叠好的7厘米中速滤纸，使尖端向下放入小杯子中，以渗透于滤纸锥形 - 体内的清液供测试硝态氮、铵态氮和速效钾备用。 ②测定土壤速效怜供试液的制备（此为供试液II）。

称取相 当于2克干土的湿土，放入干净的小浸提杯中，用量筒加人0。5 摩尔/升碳酸氢钠（NaHC03）浸提剂10毫升，盖好杯子，振荡 和渗滤方法同供试液工。

③植物供试液的制备（此为供试液IE）。果树根系自土壤中 吸收的无机养分，在果树根系、枝、叶等组织液中有所积累，用 组织汁液测定它们的含量，可以反应土壤养分的供应状况，作为 营养水平的指标。

制备植物供试液的方法很多，现介绍用冷水浸 提制备供试液：把处理好的果树待测部位（一般是叶片或叶柄）取下，用剪 刀剪碎，在1/100托盘天平上称样0。5克，放入小浸提杯中，并 用玻璃棒捣碎，然后加蒸馏水10毫升，盖好杯子纪振荡和渗滤 步骤同土壤供试液的制备。

第二步：果园土壤和果树植株速效氮磷钾养分的测定。①土壤和植株中硝态氮（N03— N）的测定3制备标准色阶 和供试液中硝态氮的测定，可同时在比色盘中，按硝态氮测定表 5 - 5进行。

表格里的双线左上方，为制备比色标准溶液，。

双线的右上方 为待测试液，只有在标准溶液和待测溶液都按要求依次制备好 后，才能同时按双线以下各操作步骤进行。

8.目视比色法的缺点

目视比色法的主要缺点是准确度不高，如果待测液中存在第二种有色物质，甚至会无法进行测定。另外，由于许多有色溶液颜色不稳定，标准系列不能久存，经常需在测定时配制，比较麻烦。虽然可采用其某些稳定的有色物质 （ 如重铬酸钾、硫酸铜和硫酸钴等 ） 配制永久性标准系列，或利用有色塑料、有色玻璃制成永久色阶，但由于它们的颜色与试液的颜色往往有差异，也需要进行校正。

9.大家能不能介绍一下比色法

通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。

比色法作为一种定量分析的方法，开始于19世纪30~40年代。比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。

选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。 常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律[1](A=εbc)为基础。

常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。

光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。

但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能 得到一定波长范围的复合光 ， 而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。20 世纪30~60年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。