基因工程转化方法(基因工程中转化的方法)

1.基因工程中转化的方法有哪些

通过转化将载体DNA导入受体菌继而得到含有目的DNA插入的转化菌株是构建DNA文库最为关键的一步。

化学法（化学药物如氯化钙等）转化

氯化钙法转化细胞 细菌处于0℃及CaCl2低渗溶液中时，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理促进细胞吸收DNA复合物。

直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。具体做法：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别载人不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。但这种方法工作量大，具有一定的盲目性。20世纪80年代以后，随着DNA核苷酸序列分析技术的发展，人们已经可以通过DNA序列自动测序仪对提取出的基因进行核苷酸序列分析，并且通过一种扩增DNA的新技术（也叫PCR技术），使目的基因片段在短时间内成百万倍地扩增。上述新技术的出现大大简化了基因工程的操作技术。

2.转基因技术的转化方法

遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株通常可分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，比较成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是中国科学家提出的。

农杆菌介导转化农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。

因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，自从技术瓶颈被打破之后，农杆菌介导转化在单子叶植物中也得到了广泛应用，其中水稻已经被当作模式植物进行研究。花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。

该方法于80年代初期由中国学者周光宇提出，中国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

核显微注射法核显微注射法是动物转基因技术中最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA片段。

-这种方法的缺点是效率低、位置效应（外源基因插入位点随机性）造成的表达结果的不确定性、动物利用率低等，在反刍动物还存在着繁殖周期长，有较强的时间限制、需要大量的供体和受体动物等特点。详细步骤：在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。

用这种方法生产的动物约有十分之一是整合外源基因的转基因动物。基因枪法利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。

与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是转基因研究中应用较为广泛的一种方法。

精子介导法精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给发情母畜授精。

在母畜所生的后代中，就有一定比例的动物是整合外源基因的转基因动物。同显微注射方法相比，精子介导的基因转移有两个优点：首先是它的成本很低，只有显微注射法成本的1/10。

其次，由于它不涉及对动物进行处理，因此，可以用生产牛群或羊群进行实验，以保证每次实验都能够获得成功。核移植转基因法体细胞核移植是一种转基因技术。

该方法是先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞细胞核移植到受体细胞——去核卵母细胞，构成重建胚，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到转基因的克隆动物。体细胞核移植法先在体外培养的体细胞中进行基因导入，筛选获得带转基因的细胞。

然后，将带转基因体细胞核移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎。重构胚胎经移植到母体中，产生的仔畜百分之百是转基因动物。

3.基因工程包括哪些步骤

基因工程的主要操作步骤包括：⑴目的基因的制备，所谓目的基因就是按照设计所需要转移的具有遗传效应的DNA片段。

目的基因可以人工合成，也可以用限制性核酸内切酶从基因组中直接切割得到。⑵目的基因与克隆载体的重组，所谓克隆载体就是承载和保护目的基因带入受体细胞的运载者，如质粒，λ噬菌体，病毒等。

⑶重组体转入受体细胞，所谓受体细胞就是接受外源目的基因的细胞，大肠杆菌是用得最多的原核细胞受体，另外，动物细胞、植物细胞都可作为受体细胞，把带有目的基因的重组体转入受体细胞要用到各种物理的、化学的和生物的方法。⑷克隆子的筛选和鉴定，带有目的基因的克隆子有没有组合到受体细胞的基因组中去，目的基因有没有在宿主细胞中通过转录、翻译表达出预先设计中想要得到的产物和表达产物如何分离、纯化等技术内容。