细胞成分或结构分离中的保护方法(细胞组分的分级分离时分离的方法有几种)
1.细胞组分的分级分离时分离的方法有几种
试想一下，若没有各种方法来分离组成细胞的不同区室和组分，那么现代生物学将困难重重。
从细胞信号通路 到新陈代谢，人们一直想知道，它们在哪儿，过去、现在及将来。赛默飞世尔科技 的市场部经理Monica O'Hara Noonan介绍，研究人员对细胞进行分级分离（fractionate）的原因有很多。
他们可能希望，当感兴趣的蛋白在某些条件下或某种处理之后转位时，对其进行追踪。对细胞进行分级分离能增强低丰度蛋白的检测能力，或降低下游分析或功能分析的复杂性。
如果您正在从事这一方面的研究，请继续往下读。从细胞 上讲，我们会帮助您将小麦和谷壳分开。
细胞的组分 如何对细胞进行分级分离取决于很多因素，包括哪些仪器 、知识可以利用，您想要分离什么，以及这些组分的下游应用是什么。离心是细胞分级分离中最常用的技术之一，它们单独使用，或与其他方法结合。
例如，对于高尔基体 或过氧化物酶体，大部分操作都要求高速的密度梯度离心。然而，O'Hara Noonan也指出，超速离心也有一些缺点，包括超速离心机是高价的仪器，有些实验室无法接触到。
另外，密度梯度难以倾倒是出了名的，其结果是技术依赖的。当然，其他的许多组分也可以只利用试剂和台式仪器来富集。
供应商开发出一些试剂盒，能方便快捷地带来高度富集的细胞组分。赛默飞世尔 全新设计的Mem-PER Plus试剂盒，能在一小时之内富集完整的膜相关蛋白。
据sigma-aldrich 的产品专家Michael Moehlenbrock介绍，这类试剂盒的原理在很大程度上是类似的。它们往往使用低渗缓冲液给细胞膜带来压力，然后用等渗的提取缓冲液（带或不带还原剂和蛋白酶抑制剂）来维持感兴趣的细胞器。
有时也需要机械裂解或去污剂裂解。“各个不同供应商在细胞分级分离试剂盒的设计上都是一致的，而不同细胞组分的差异在于缓冲液组成、裂解试剂和离心速度，”Moehlenbrock说。
此类试剂盒的价值并不在于某些秘密试剂，而在于QC系统的一致性和重复性。“细胞分级分离的方法已经过充分鉴定，其操作步骤适用于大部分应用，”Moehlenbrock说。
“商业化试剂盒为最终用户带来了简便和效率，同时提供了品质保证的安全性。” 通过改变穿插在离心步骤之间的缓冲液的去污剂组分，研究人员可分离不止一个组分。
例如，市场上许多试剂盒可收集细胞核和胞浆蛋白。其他试剂盒也带来了三个或四个不同的组分。
Cell Signaling Technology的Cell Fractionation Kit产生了细胞质、细胞膜/细胞器以及细胞核/细胞骨架组分，而QIAGEN的Qproteome Cell Compartment Kit分离出细胞质、细胞膜、细胞核和细胞骨架组分。美天旎提供一种不含去污剂的试剂盒，它利用TOM22抗体标记的磁珠来特异分离线粒体。
据该公司的技术支持介绍，他们不提供其他亚细胞组分的产品，但客户可以利用自己的抗体来间接分离其他组分。同样地，赛默飞世尔的Cell Surface Protein Isolation Kit标记细胞表面蛋白的外部赖氨酸，它具有一个可切割的生物素衍生物，让此蛋白组分在细胞裂解后可被捕获。
其中有什么 在细胞组分被分离出来之后，必须验证您的实验，并确认这些组分确实包含了您要分离的。尽管这些试剂盒通常不包含区分各种组分的试剂，但许多会指出不同的看家基因，让您用来确保质量。
Moehlenbrock表示：“在某些情况下，我们会提供分析的建议。”例如，Sigma-Aldrich Mitochondria Isolation Kit的技术指南建议检查细胞色素c氧化酶活性和柠檬酸合酶活性，以确认外膜和内膜的完整性。
Cell Signaling Technology也提供Cell Fractionation Antibody Sampler Kit，作为分级分离试剂盒的伴随产品。生产科学家Jim Cormier介绍，当您在运行Western时，您会得到一个量化值，哪些组分占多少。
Sampler Kit包含细胞质MEK1/2、线粒体凋亡诱导因子（AIF）、组蛋白H3和细胞骨架波形蛋白的兔单克隆抗体，以及山羊抗兔IgG。研究人员也可利用试剂盒中的建议，或搜索文献，组装自己的Western blot或ELISA试剂盒。
不过Cormier也提醒，并非每个抗体都有着它应有的特异性。下游的分析 与超速离心相比，基于试剂盒的细胞分级分离方法快速又方便，也适合多个下游应用，如EMSA、报告基因分析、酶活分析和Western blot。
然而，制备过程中所使用的去污剂和盐可能阻碍蛋白质组学的应用，如质谱，“这有时取决于去污剂的量，去除的容易程度，以及是否用于功能分析，”O'Hara Noonan说。“在某些情况下，您可能需要透析或脱盐。”
同样地，有时可能需要额外的步骤，来增加产物的纯度。在读研究生时，Moehlenbrock一般使用台式离心机来制备线粒体。
“有时我会用11,000 x g来去除细胞碎片。之后获得线粒体提取物，并用蔗糖梯度和超速离心机来进一步纯化。
这取决于您想做什么，。
2.简述主要免疫细胞分离方法和分离原理
免疫磁珠法分离细胞原理：免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。
免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法：阳性分离法-磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞 阴性分离法-磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞 一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。BD™ Imag 磁珠：· 大小在0.1-0.45mm · 包被了BD Pharmingen生产的高质量单抗 · 磁珠已为白细胞亚群的阳性和阴性分离法所优化 · 用于BD™ IMagnet direct magnet 将包被了特异性单抗的BD IMag磁珠加入细胞悬液，磁珠特异性地与有相应抗原的细胞亚群结合，通过BD™ IMagnet direct magnet分离得到的连有BD IMag磁珠的细胞可直接用于功能试验和用流式细胞仪检测。
缺点：• 对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养 • 纯度低 • 容易阻塞FCM的喷嘴 BD IMag吸收大磁珠和小磁珠分离系统的优点，开发出直径约200nm中等大小磁珠。• 技术简单，分离在普通的试管中完成 • 易于增大细胞用量 • 对细胞温和，不影响细胞功能及其分离后培养，可直接上流式 • 纯度高，回收率高 • 成本低 此外，Mouse lineage panel中biotin标记的抗体还可用于FCM分析细胞表面抗原，以及进行细胞/组织免疫荧光实验。
BD提供2种免疫磁珠：· 包被了针对白细胞亚群的单抗的磁珠 · 包被了链霉亲和素（streptavidin）的磁珠：此种情况下，在实验系统中加入生物素标记的单抗，磁珠通过streptavidin与生物素标记的单抗结合，单抗与细胞表面相应抗原特异性结合而使细胞被磁珠间接捕获，从而达到分离。这种磁珠使研究者可根据自己需要选择生物素标记的各种单抗去分离目的细胞，应用范围更广泛，使用更灵活。
不同物种磁珠分离试剂 人： CD3, CD4, CD8, CD14, CD19；小鼠： CD4, CD8a, CD14, CD45R/B220, CD90.2 (Thy1.2), CD11b, Ly-6G.ë 利用Streptavidin连接的磁珠，只需选配biotin标记的所需单抗，就能分离更多种类细胞 新货聚焦：现在，BD PMG又推出用于分离小鼠造血干细胞/祖细胞的新试剂mouse lineage panel。其中包括5种biotin标记单抗，这些单抗能结合小鼠造血细胞的主要分化系细胞： T、B淋巴细胞，单核/巨噬细胞，粒细胞和红细胞。
将这组试剂与Streptavidin Plus BD™ IMag Particles (557812) 联合使用，就能通过免疫磁性分离法去除小鼠骨髓造血细胞的主要分化系细胞，从而富集到造血干细胞和祖细胞（阴性片断）。Mouse Lineage Panel(559971):(5*2ml/vial) 可分离109 Mouse骨髓细胞1) Biotin-anti-mouse CD3e (CD3 e chain);2) Biotin-anti-mouse CD11b;3) Biotin-anti-mouse CD45R/B220;4) Biotin-anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1);5) Biotin-anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Ly-76) 磁分离细胞的重要指标是：纯度和得率，这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性，也无法直接上流式。
目前市场上有2种磁性细胞分离系统：* Small particles （≈50 nm） - MACS* Large particles (1200~4500 nm) -others（如Dynal） 小磁珠 优点：• 对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养 • 可直接上流式检测，不影响散射光 缺点：• 需要很强的磁场来分离细胞 • 分离速度很慢，得率不高 • 需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行 • 成本昂贵 大磁珠 • 技术简单，分离可在试管中完成 • 易于增减细胞用量 • 速度快，得率高 • 成本低。
