核酸分子的标记方法(有几种核酸标记的方法)

1.有几种核酸标记的方法

通过核酸标记技术可将细胞因子cDNA作为基因探钊检测细胞内细胞因子 基因组 DNA或mRNA。主要有以下几种方法：

1.应用同位素（或非同位素）标记的cDNA探针，检测经Northern blot后细胞因子mRNA水平或采用打点杂交法。

2.应用标记cDNA探钊与细胞或组织切片进行原位杂交，然后进行放射自显影。

3.细胞因子mRNA经反转录为cDNA，用特异性细胞因子引物经聚合酶链反应（PCR）扩增细胞因子cDNA,Southern blot后用标记探针检测特异细胞因子DNA水平。

2.分子标记的方法有哪些

一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。

① 限制性片段长度多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP） 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性（RFLP）技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。

通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。

由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。

RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。

自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。② 数目可变串联重复多态性 （Variable Number of Tandem Repeats,VNTR） 数目可变串联重复序列又称小卫星DNA (Minisatellite DNA)，是一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10一10001不等。

VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：（1）限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。（2）内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。

（3）分子杂交所用DNA探针核昔酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。 小卫星标记的多态信息含量较高，在17一19之间。

缺点是数量有限，而且在基因组上分布不均匀，这就极大限制其在基因定位中的应用。VNTR也存在实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点。

编辑本段二、基于PCR技术的分子标记技术 （一）、随机引物的PCR标记 所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的 DNA 区域事先未知。随机引物PCR扩增的 DNA 区段产生多态性的分子基础是模板 DNA 扩增区段上引物结合位点的碱基序列的突变，不同来源的基因组在该区段上表现为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。

随机引物PCR标记表现为显性或共显性。① 随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD) RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。

基本原理：它是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。

RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。

与RFLP相比，RAPD具有以下优点：（1）技术简单，检测速度快；（2） RAPD分析只需少量DNA样品；（3）不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析；（4）成本较低。但RAPD也存在一些缺点：（1） RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；（2）存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段；（3） RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。

② 任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction, AP—PCR) 在AP—PCR分析中，所使用的引物较长（10-50 bp） , PCR反应分为两个阶段，首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。

采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对。

3.分子标记方法

分子标记 在农业基础与应用研究领域，分子标记技术已开始应用于作物种质资源和育种的研究，特别是在构建分子遗传图谱和标记目的性状基因方面取得了很大的进展。

形态标记（morphologica markers）即植物的外部特征特性，如株高、穗长、粒色、千粒重等。此种形态标记简单直观，但是形态标记数少、多态性差、易受环境条件影响。

在小麦抗叶锈病基因标记方面，SINGH[5]曾利用形态标记发现慢叶锈基因Lr34和小麦叶片尖部坏死基因紧密连锁。 细胞标记（cytological markers）主要是染色体核型（染色体鼠数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（C带、N带、G带等），这类标记的缺点是数目有限。

目前，还未发现用其进行小麦抗叶锈基因的标记。 生化标记（biochemical markers）主要包括同工酶和储藏蛋白。

生化标记具有经济方便的优点，但其标记数有限。DAVlD[6]等曾利用生化标记内肽酶同工酶EP-Dld作为遗传标记对以Thatcher为背景的小麦抗叶锈病近等基因系进行连锁分析，发现EP-Dld与Lr19紧密连锁，重组值为（0.01士0.09）个作图单位。

WINZELER[7]等利用含Lr19的小麦抗叶锈病近等基因系，发现生化标记内肽酶同工酶EP-Dl的无效等位基因EP-Dlc可以作为与 Lr19紧密连锁的生化标记，遗传距离为（0.33士0.33）cM。 分子标记与形态标记、细胞标记、生化标记相比较，有以下几方面的优点：①在植物体的多个组织及生育阶段均可检测到，不受时空限制。

②数量多，遍及整个基因组。③有许多标记表现为共显性，能够鉴别基因型纯合与否，提供完整的基因型。

在标记小麦抗叶锈病基因方面，分子标记可以在更深层次上揭示小麦抗锈遗传机制。通过找到与抗锈基因紧密连锁的分子标记，不但能在遗传背景不同的育种材料中特异性的检测目的基因，而且可以在任一生育阶段同时对多个抗性基因进行筛选，这为了解抗源和抗病品种中所含有的抗性基因提供了更为迅速、稳定、可靠的方法。

目前，用于标记小麦抗叶锈病基因的分子标记主要有以下几种： 2.l RFLP技术在小麦抗叶锈病基因标记中的应用 RFLP(restriction fragment length polymorphism)作为遗传分析的工具开始于1974年，80年代开始应用于植物。其基本原理是物种的基因组DNA在限制性内切酶的作用下，产生相当多的、大小不等的DNA片段，用放射性同位素标记的DNA做探针把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱；它所代表的是基因组 DNA在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上的差异。

RFLP技术被广泛应用于小麦遗传图谱的构建标记和定位小麦的目的基因。 在小麦抗叶锈病基因的RFLP标记方面，SCHACHERMAYR等[8]将一编码受体蛋白激酶的Lrkl0基因的3.9Kb的HindⅢ片段用 PstⅠ分成六个亚片段，将这些亚片段作为RFLP标记，寻找到了特异的Lrk10片段可作为与小麦抗叶锈病基因Lr10紧密连锁的分子标记，将这一亚片段与已知抗性基因的单基因系进行Southern杂交，发现这一3.9Kb的HindⅢ片段仅存在于携带抗叶锈病基因Lr10的近等基因系中。

进一步将此 RFLP标记Krkl0-6转变为STS标记STSLrkl0一6，发现一282bp的片段仅存在于携带Lr10的品种中，F2群体分离进一步证明此 282bp的片段与Lr10紧密连锁。SCHACHERMAYR等[9]利用近等基因系找到了与抗叶锈病基因Lr24紧密连锁的RFLP和RAPD的标记。

在供试的115个RFLP探针中，其中6个与Lr24紧密连锁，从360个随机RAPD引物中，找到了11个能够揭示多态性的引物，其中一个与 Lr24紧密连锁，并将该RAPD产物克隆、测序将其转化为更为稳定可靠的STS标记，为分子标记辅助育种打下了良好的基础。FEUILLET等[10] 利用小麦抗叶锈病近等基因系Lr1/6*Thatcher和Thatcher及感病品种Frisal，通过F2群体分离，将37个RFLP中的16个定位在了第五部分同源群，而且能在Lr1/6*Thatcher和Frisal之间揭示多态性，I1个RFLP探针能在近等基因系间揭示多态性，F2群体分离分析发现，其中3个与抗性基因连锁，其中一定位在染色体5D上的探针pTAG621证明与Lr1紧密连锁，并将这一RFLP标记转化为了更为可靠的STS 标记。

AUTRIQUE[11]等利用4种含不同抗性基因的小麦近等基因系，根据抗性基因在其染色体上所处的位置选择克隆，同时，从大麦的RFLP连锁图谱和D一基因组RFLP图谱中，挑选了其它的克隆。通过杂交的方法来寻找多态性分子标记。

结果发现，定位在染色体7DL和3DL上的8个分子标记，与抗性基因Lr19和Lr24共分离；来自Aegilops umbellulata的Lr9，被定位在染色体6B上，一克隆XksuD27与Lr9共分离，以及与Lr32紧密连锁的两个RFLP标记，遗传距离分别为（3.3土2.6）cM和（6.9土3.6）cM。 2.2 小麦抗叶锈病基因的RAPD标记 NAIK等[12]利用含Lr28的抗叶锈病近等基因系，从80个随机引物中找到了一个能在供体亲本和轮回亲本中揭示多态性的RAPD标记OPJ一 O1。

将此387bp的多态性产物克隆、测序，将其设计成更为稳定的STS标记，利用BSA法，对F3群体进行分析，发现387bp的特异性产物只出现在抗性群体中，而在感病群体中表现缺失。证明了RAPD标记OPJ一O1和STS 。

4.DNA分子标记的种类有哪些,各有何特点

主要介绍以下四种：1 RFLP ：该技术由Grodzicker等于1974年创立特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP该技术包括以下基本步骤：DNA提取；用DNA限制性内切酶消化；凝胶电泳分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上；用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交）；放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性 RFLP标记的主要特点有：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中2 RAPD ：由Williams等于1990年创立其基本原理与PCR技术一致 PCR技术是一种体外快速扩增特异基因或DNA序列的方法，由Mullis等于1985年首创该技术在试管中建立反应体系，经数小时后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数百万倍其原理与细胞内发生的DNA复制过程相类似，首先是双链DNA分子在邻近沸点的温度下加热时便分离成两条单链DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互补链，以上过程为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，经过20-30个循环后，介于两个引物间的特异DNA片段以几何数得以大量复制 RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加缺少或发生分子量变化若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记 RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低 3 AFLP ：由Zabeau和Vos于1993年发明AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来该技术结合了RFLP的稳定性和PCR技术的简便高效性，同时又能克服RFLP带型少信息量小以及RAPD技术不稳定的缺点其基本技术原理和操作步骤如下：首先用限制性内切酶酶解基因组DNA，形成许多大小不等的随机限制性片段；接着在这些片段的两端连接上特定的寡聚核苷酸接头（Oligo nuleotide adapter）；然后根据接头序列设计引物，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3端加入1-3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的；最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开来 AFLP标记的主要特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高 4 SSR(SSLP) ：由Moore等于1991年创立SSR即微卫星DNA，是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n(AT)n(GGC)n等重复不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSR标记 SSR标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高.。

5.DNA分子标记技术有哪几类要说出它们各

分子标记大多以电泳谱带的形式表现， 大致可分为三大类。

第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术， 包括：（1） 限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism， 简称 RFLP 标记）； （2） DNA 指纹技术（DNA Fingerprinting）; (3) 原位杂交（in situ hybridization） 等；

第二类是以 PCR 反应为核心的分子标记技术， 包括：（1） 随机扩增多态性 DNA 标记（Random amplification polymorphism DNA， 简称 RAPD 标记）； （2） 简单序列重复标记（Simple sequence repeat， 简称 SSR 标记） 或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism， 简称 SSLP 标记）； （3） 扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism， 简称 AFLP 标记）； （4） 序标位（Sequence tagged sites， 简称 STS 标记）； （5） 序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region， 简称 SCAR 标记） 等；

第三类是一些新型的分子标记，如： （1） 单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism， 简称 SNP 标记）； （2） 表达序列标签（Expressed sequences tags， 简称 EST 标记） 等。