蛋白质含量测定用什么方法方法(测定蛋白质含量的方法,其原理各是什么)

1.测定蛋白质含量的方法有哪些,其原理各是什么

Bradford法测定蛋白质浓度 （一）实验原理 双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋 白质溶液测定的方法。

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白 质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定 法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465nm变为595n m，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。

这是因为蛋白质与染料结合后产生 的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的 多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的 过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。

如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不 干扰此测定法。

2.蛋白质含量的测定都有哪几种方法,适用情况以及优缺点

①凯氏定氮法 原理：蛋白质平均含氮量为16%。

当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。 ②双缩脲法 原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。

蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。

缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 （数mg），且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。

③Folin酚法（Lowry） Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。

在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+, Cu+能定量地与Folin-酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。 灵敏度较高（约 0.1 mg），但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。

步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。 ④紫外法 280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。

280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算： 蛋白质浓度（mg/ml）=1.24E280-0.74E260 (280 260为角标) ⑤色素结合法（Bradford 法） 直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。 考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。

CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。

当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。

间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。

⑥BCA法 BCA(Bicinchoninc acid procedure,4,4'-二羧-2,2'-二喹啉)法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。 它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。

灵敏度Lowry法相似。 本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。

⑦胶体金测定法 胶体金（colloidal gold）是氯金酸（chloroauric acid）的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。 胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。

⑧其他方法 有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 （如镉），则可追踪该金属。

3.蛋白质定量测定的方法有哪些

定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。考马斯亮蓝法（Bradford法）。

凯氏定氮 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2% 费时

8~10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长

双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低 1~20mg 中速 20~30分钟 多肽键+碱性Cu2+®紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似

紫外吸收法 较为灵敏 50~100mg 快速 5~10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；

Folin-酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高 ~5mg 慢速 40~60分钟 双缩脲反应；磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；

各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化

考马斯亮蓝法（Bradford法） 灵敏度最高 1~5mg 快速5~15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；

SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化

4.蛋白质含量测定的基本方法有哪些

pro的测定方法分为两大类：一类是利用pro的共性，即含氮量，肽链和折射率测定pro含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定pro含量。

但是食品种类很多，食品中pro含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此pro的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出pro的含量。由于食品中pro含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。

5.蛋白质含量测定药典规定必须用什么方法

使用凯氏定氮的方法检测蛋白质含量。

凯氏定氮法 凯氏定氮法

蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法介绍

【GB/T 5009.5—1985】

食品中蛋白质的测定方法

本标准适用于各类食品中蛋白质的测定。

1 原理

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

2 试剂

所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。

2.1 硫酸铜。

2.2 硫酸钾。

2.3 硫酸。

2.4 2%硼酸溶液。

2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

2.6 40%氢氧化钠溶液。

2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液。

3 仪器

定氮蒸馏装置：如图所示。

（图略）

4 操作方法

4.1 样品处理：精密称取0.2~2.0g固体样品或2~5g半固体样品或吸取10~20ml液体样品（约相当氮30~40mg），移入干燥的 100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20ml 水。放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。

4.2 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

4.3 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。

同时吸取10.0ml试剂空白消化液按4.3操作。

4.4 计算

式中：X——样品中蛋白质的含量，%；

V1——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml;

V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml;

N——硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

0.014——1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

m——样品的质量（体积），g(ml);

F——氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15~17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。

附加说明：

本标准由全国卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出，由卫生部食品卫生监督检验所归口。

本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。

6.利用蛋白质的成色反应测定蛋白质的含量的方法有哪些

通常有三种方法：

(1)茚三酮反应（ninhydrin reaction）

蛋白质水解后产生的氨基酸可发生茚三酮反应。除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的α氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。α氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色，最终为蓝色物质。脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。该反应可广泛用于各种氨基酸的定性或定量测定。

(2)双缩脲反应（biuret reaction）

蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。该反应是肽键常用的反应，即在碱性铜溶液中，肽键与铜离子形成络合物，呈紫色（在540nm有最大光吸收峰）。

(3)考马斯亮蓝法：

即蛋白质与一种蛋白质染料考马斯亮蓝G250反应形成复合物，该复合物在595nm有最大光吸收峰。

注意：蛋白质遇硝酸也显色为黄色，不过这样蛋白质就变性了。