测定蛋白质构象方法(测定蛋白质的构型和功能要用什么仪器,步骤)

1.测定蛋白质的构型和功能要用什么仪器,有哪些步骤

你好，很高兴回答你的问题。

构型这个概念是指 一个有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。这种排列不经过共价键的断裂和重新形成是不会改变的。构型的改变往往使分子的光学活性发生变化。蛋白质的构型就是一级结构，指其氨基酸排列顺序。

测定蛋白质的构型的主要有两种方法：Edman降解（Edman degradation）和质谱法。

EDMAN降解法测序是经典的方法，通过从多肽链游离的N末端（或者C末端，但是很少）测定氨基酸残基的序列的过程。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，现在一般都是自动测序仪。

质谱法测蛋白只要是利用生物质谱仪，比如ESI-Q-TOF,ESI-IT-Obitraq。利用特异的酶将蛋白切成肽段， 然后通过质谱方法进行测定，产生数据或通过重头比对，或者通过生物信息学中数据库搜索的方法推断出肽段序列，然后再由肽段序列拼接处蛋白序列。这种方法是近些年来随着蛋白质组学的发展而广泛被使用，但是对于蛋白完整序列测定需要较强的生物信息学技术。

整体而言， EDMAN降解法准确， 但是耗时长， 而且对于所测定的肽段要求很高， 不能太长， 不能太难修饰等等， 一般能测个20-50碱基不错了。而质谱法方法快速，但是准确性比EDMAN降解法略差。

另外，楼主讲的蛋白功能测定，不同的蛋白质功能各异，蛋白功能主要通过生物学实验反复验证次得到，这个比较复杂，没有固定的模式，要逐一研究。

另外，像核磁仪可以用来研究蛋白的构象或者说晶体结构，表面等离子共振仪器可以用来研究蛋白蛋白相互作用，等等，蛋白质是未来有限的生物研究资源，现在全世界对蛋白质的研究热情都很高。也有许多相关的基础科教书，楼主感兴趣可以去看看。

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2.测量蛋白质等电点的方法有哪些

等电点：如果调节溶液的PH值使得其中的氨基酸呈电中性，我们把这个PH值称为氨基酸的等电点：PI。PI是氨基酸的重要常数之一，它的意义在于，物质在PI处的溶解度最小，是分离纯化物质的重要手段。

等电点的计算：对于所有的R基团不解离的氨基酸而言（即解离只发生在α-羧基和α-氨基上），计算起来非常简单：PI=(PK1'+PK2')/2若是碰到R基团也解离的，氨基酸就有了多级解离，这个公式就不好用了，比如Lys、Glu、Cys等。aa Cys Asp Glu Lys His ArgPK'α-羧基 1.71 2.69 2.19 2.18 1.82 2.19PK'α-氨基 8.33 9.82 9.67 8.95 9.17 9.04PK'-R-基团 10.78(-SH) 3.86（β-COOH） 4.25（γ- COOH） 10.53（ε-NH2） 6（咪唑基） 12.48（胍基）在这种情况下可以按下面的步骤来计算：

<1&gt； 由PK'值判断解离顺序，总是PK1'< PK2'< PK3'&lt； …，即谁的PK'值小，谁就先解离。

<2&gt； 按照解离顺序正确写出解离方程式：简式，注意解离基团的正确写法。<3&gt； 找出呈电中性的物质，其左右PK'值的平均值就是氨基酸的等电点：PI=(PK左'+PK右')/2以Lys为例：在黑板上用简式演示

<3&gt；等电点的测定：等电聚焦法：这是一种特殊的电泳，其载体上铺有连续的PH梯度的缓冲液，然后将氨基酸点样，只要该处的PH与氨基酸的PI不同，则氨基酸就会带电，PH值>PI时，aa带-电；PH值<PI时，aa带+电。通电后，氨基酸就会移动，直到某处的PH=PI，氨基酸才呈电中性，不再移动，因此，可以测出PI。等电点沉淀所有的氨基酸均为两性物质，亦即它们至少含有一个酸性基（carboxyl）及一个碱性基（α-amino）。

这些可游离的团基在pH变化时，因释出或接受质子而可充当弱酸或弱碱，其离子化特性与其它物质一样遵守Henderson-Hasselbalch方程式：pH = pKa + log10 [未质子化的形式（碱）] / [已质子化的形式（酸）]即pH = pKa + log [A-] / [HA] 氨基酸可以三种形式存在，即正电荷（cation）、两性离子（zwitterion）或双极性离子（dipolar ion）及负电荷（anion）等三种，若在酸性溶液中带正电荷，则在碱性溶液中带负电荷。若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0，且在电场中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电点）。因为净电荷为零，净电斥力不存在的缘故，大部份蛋白质於等电点的pH值下，其溶解度最小。相反的，当溶液的pH值低於或高於pI，所有蛋白质分子所带净电荷必为同号，彼此之间有相斥力，不会凝结。所以，将pH调到等电点的大小，则大部份的蛋白质将会沉淀，这种现象可以应用於估算某蛋白质的等电点.

3.测定蛋白质含量的方法有哪些,其原理各是什么

Bradford法测定蛋白质浓度 （一）实验原理 双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋 白质溶液测定的方法。

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白 质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定 法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465nm变为595n m，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。

这是因为蛋白质与染料结合后产生 的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的 多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的 过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。

如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不 干扰此测定法。

4.=测定蛋白质分子量的主要方法有哪些

知道蛋白质分子量、氨基酸组成计算器 .cn/tools/mwcal/ 一般的方法： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量 [原理] 十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate， 简称SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在实验基础上发展起来的一项新技术。

用这种方法测定蛋白质的分子量具有快速灵便，设备简单等优点。 蛋白质的电泳迁移率在一般的电泳方法中，主要取决于它在某PH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性，而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对大多数蛋白质，主要取决于它们的分子量，与原有的电荷量和形状无关。

SDS是一种阴离子表面活性剂，在一定的条件下，它能打开蛋白质氢键和疏水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，每克蛋白质一般结合1.4克SDS。SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物均带上相同的负电荷，其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质间原有的电荷差异。

在水溶液中，蛋白质-SDS复合物具有相同的构象，近似雪茄烟形的长椭园棒（短轴均为1.8nm，长轴则随蛋白质的分子量成正比变化），克服了蛋白质间原有的形状差异。这样蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。

蛋白质分子量与电泳迁移率间的关系可用下式表示：lgMr = K – bm 式中 Mr为分子量；K为常数；b为斜率；m为迁移率。 因此，用本法测定蛋白质的分子量只需根据待测蛋白质在已知分子量的标准蛋白质的lgMr~迁移率的图中的位置，就能得知分子量。

用本法测得的分子量，除单链蛋白质外，均不是天然蛋白质的完整分子量，而是组成这些蛋白质的亚基或肽链的分子量。本法对一些电荷异常，或构象异常，或带有大辅基的蛋白质不适用，如组蛋白F1和某些糖蛋白等。

对一些结构蛋白如胶原蛋白等也不适用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按照凝胶电泳系统中的缓冲液、pH值和凝胶孔径的差异可分为SDS-连续系统电泳和 SDS-不连续系统电泳两类；按照所制成的凝胶形状和电泳方式又可以分为SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直管型电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳两类。

本实验采用SDS-不连续垂直板型操作方法。通过实验使学生掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板式电泳的原理及技术，包括制胶、灌胶、加样、剥胶及固定染色等，学会用这些方法测定蛋白质分子量。

[方法与步骤] 一、加样液的制备 1、标准蛋白质加样液的制备 称取细胞色素，胰凝乳蛋白酶原，胃蛋白酶，卵白蛋白，牛血清白蛋白各0.5~1mg，置小离心管（Eppendorf管）中，加入样品溶解液1mL，充分溶解，如有不溶物应离心除去。沸水浴热处理3min，冷却备用。

2、待测蛋白质加样液的制备 根据待测蛋白质样品存在的状况而定。（1）固体 待测蛋白样品，如为无盐的纯蛋白质固体制剂，加样液的制备方法同标准蛋白质加样液的制备；如为含盐的纯蛋白质固体制剂，应先加水充分溶解，对透析缓冲液透析12~16h，然后吸取0.5mL（蛋白浓度应为0.5~1mg/mL），置Eppendorf管中，并加入等体积浓样品溶解液，沸水浴热处理3min，冷却备用。

（2）液体 待测蛋白样品，如为无盐的纯蛋白质液体制剂，则加入等体积浓样品溶解液，然后热处理；如为含盐的液体制剂，则需先透析。二、凝胶的制备1、凝胶板的准备 （1）洗板 将洗洁精用温水稀释后，用它浸透海绵擦洗玻板，然后用自来水洗净，再用酒精将板擦干。

（2）安装制胶板 制胶前将玻板与塑料嵌条和凹型陶瓷板的边缘对齐，下沿用密封胶带封口，用塑料夹子或铁夹子将两端夹好，注意要确保密封，安放在固定架上。2、分离胶和浓缩胶溶液的配制 组 分 分离胶/mL 浓缩胶/mL 凝胶贮备液 2.5 0.26 分离胶缓冲液（pH8.8） 1.9 — 浓缩胶缓冲液（pH6.8） — 0.510%SDS 0.075 0.02 TEMED 0.026 0.02 双蒸水 3.05 1.2210%过硫酸铵 0.013 0.02 总体积 7.6 2 注意：①最后加入10%过硫酸铵溶液，混合制成凝胶液，迅速灌制凝胶。

②丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用。因此必须小心操作，不得吸入和接触皮肤，聚合完全聚丙烯酰胺凝胶无毒。

3、制分离胶 将制胶板垂直放好，插上与相应厚度的样品梳，在梳子下缘线1cm处做标记，卸下样品梳。将配好的分离胶溶液缓慢加入制胶板之间，直至液面达到标记处。

用滴管贴近胶液界面小心而又缓慢地覆盖厚度约0.5cm的正丁醇层，以防止溶液蒸发并保证胶面平整。4、制浓缩胶 分离胶聚合后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗分离胶胶面两次，用滤纸吸去残液。

用滴管将浓缩胶溶液加在分离胶面上，充满制胶板，插入样品梳。（三）电泳1、安装电泳槽 浓缩胶聚合后，除去梳子、密封胶带以及六个铁夹。

将制胶扳、电泳糟内芯、另一对制胶板依次放入槽内。两制胶板的凹型陶瓷板均应与电泳槽内芯接触。

然后插入楔型板以固定两套制胶板。如果每次电泳只用一块胶板，必须用提供的有机玻璃板代替另一套制胶板。

2、加样 在内外水槽加注缓冲液，使内外槽的水位均超过凹形板的缺口但低于。