蛋白质测定的方法各有什么优缺点(常用来测定蛋白质含量的方法)

1.常用来测定蛋白质含量的方法有哪些

1、凯氏定氮法

凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。

由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

优点：可用于所有食品的蛋白质分析中；操作相对比较简单；实验费用较低；结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质。

缺点：凯氏定氮法只是一个氧化还原反应，把低价氮氧化并转为氨盐来测定，而不能把高价氮还原为氮盐的形式，所以不可以测出物质中所有价态的氮含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。

当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。

优点：测定速度较快，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近。

缺点：①灵敏度差； ② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

3、酚试剂法

取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效。

缺点：①费时，要精确控制操作时间；②酚法试剂的配制比较繁琐。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。 

缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差； ②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

5、考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。

在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。

一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。

缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

参考资料来源：百度百科-蛋白质测定

2.通常蛋白质含量测定的方法有哪些,比较优缺点

定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。

考马斯亮蓝法（Bradford法）。 凯氏定氮 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2% 费时 8~10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低 1~20mg 中速 20~30分钟 多肽键+碱性Cu2+®紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 50~100mg 快速 5~10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶； Folin-酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高 ~5mg 慢速 40~60分钟 双缩脲反应；磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸； 各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法（Bradford法） 灵敏度最高 1~5mg 快速5~15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液； SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化。

3.各种常见的蛋白质定量测定方法的优缺点

一、凯氏（kjeldahl）定氮法

优点： 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少优点

①可用于所有食品的蛋白质分析中；

②操作相对比较简单；

③实验费用较低；

④结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；

⑤用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质

缺点

①最终测定的是总有机氮，而不只是蛋白质氮；

②实验时间太长（至少需要2h才能完成）；

③精度差，精度低于双缩脲法；

④所用试剂有腐蚀性.

灵敏度低 适用于0.2-1.0mg氮 干扰物质 ：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） ；费时太长

二 Folin-酚试剂法

优点：操作简便，灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。

缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

三、Bradford法的突出优点是：

(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。

(3)标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

四 紫外吸收法

优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（nh4）2so4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

缺点：测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

五、双缩脲法（Biuret法）

优点：较快速，干扰物质少，不同蛋白质显色相似

缺点：不太灵敏

4.测定蛋白质含量的方法有哪些,其原理各是什么

Bradford法测定蛋白质浓度 （一）实验原理 双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋 白质溶液测定的方法。

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白 质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定 法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465nm变为595n m，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。

这是因为蛋白质与染料结合后产生 的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的 多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的 过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。

如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不 干扰此测定法。

5.各种蛋白互作检测方法有哪些优缺点

双杂交技术 原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。 缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。

荧光共振能量转移技术 指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。 缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。 生化标记技术文档，生化标记技术文档下载，生物帮上面有介绍的。

6.标准曲线法与其他蛋白质含量测定方法比较,有何优缺点

标准曲线法又称校准曲线法，做法是将贮备标准液稀释为所需要的标准系列，用零浓度调仪器零点后，依次由低到高浓度测量标准液的吸光度（或峰高、面积），同

时测定样品和样品空白的吸光度（或峰高、面积），在坐标纸上以标准液浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。它一般适用于已知样品的基本成分

和标准液的基本成分相接近的样品。

标准加入法是分别在数份相同体积样品液中加入不等量的标准液，一定要有一份相同体积样品液中加入

的标准液为零，按照上面绘制标准曲线的步骤测量吸光度（或峰高、面积），在坐标纸上以加入的标准液浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，用

外推法（延长标准曲线和横坐标相交的数的绝对值）就可得到样品液浓度。它一般适用于组份较复杂的未知样品，能消除一些基本成份对测定的干扰，但对测定的未

知成分含量要粗略估计一下，加入的标准液要和样品液浓度接近，

优缺点：准确度较高，但是比较麻烦，要做很多标准溶液