细胞复苏步骤和(细胞冻存与复苏步骤 原理及注意事项)

1.细胞冻存与复苏步骤、原理及注意事项

去百度文库，查看完整内容>

内容来自用户：744410040

培养细胞的冷冻保存与复苏 概述 | 冻存过程 |

 冷冻保存与复苏的原理 | 冻存结果 |

 冷冻速率 | 讨论 |

 冷冻保存温度 | 冻存细胞的复苏 |

 复温速率 | 非玻璃化冻存细胞的复苏 |

 冷冻保护剂 | 主要材料 |

 冷冻保存方法 | 复苏过程 |

 非玻璃化冻存方法 | 结果 |

 主要材料 | 讨论 |

 冻存过程 | 玻璃化冻存细胞的复苏 |

 冻存结果 | 主要材料 |

 讨论 | 复苏过程 |

 玻璃化冻存方法 | 结果 |

 主要材料 | 讨论 |



Polge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet(1951)与Lovelock(1953)等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是，电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman(1956)、Rey(1957)以及在不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的

2.和注意事项细胞复苏如何进行,有哪些需要注意的事

一、\x09复苏

1.\x09把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动.液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里.

2.\x09把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟.

3.\x09把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来.吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布.

4.\x09标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基.

5.\x093天换一次培养基.

二、\x09传代

1.\x09培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代.

2.\x09把原有培养基吸掉.

3.\x09加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟.

4.\x09细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化.

5.\x09用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来.

6.\x09把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟.

7.\x09倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来.

8.\x09根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中.一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个.继续培养.

三、\x09 冻存

把细胞消化下来并离心（同上）.用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期.4℃ 30min,-20℃ 30min,-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存.

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇.

要注意的就是无菌操作！

3.求细胞复苏方法步骤和注意事项

博凌科为解答：【材料】1.常规细胞培养仪器设备 恒温水浴振荡器。

2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）【操作程序】1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。2.培养液（DMEM）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。

3.二甲基亚砜（DMSO）在40C冰箱中冷藏30min，备用。4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。

5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min,5min）。6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。

7.记录复苏日期。【注意事项】1.取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。

此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。

如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。3.离心前须加入少量培养液。

细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。4.离心问题：目前主要有两种见解。

一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大， 死亡。

此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO）,DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。

我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。5.细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml-15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

6.复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响 细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1%。

所以如果你的冻存液的浓度是 10%DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

4.细胞的冻存与复苏要注意什么 – 手机爱问

细胞冻存与复苏步骤注意事项一、原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。

如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。

贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。二、操作步骤（一）冻存1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5*106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。5、将冻存管口封严。

如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。

冻存管外拴一金属重物和一细绳。7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（-30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1~1.5月。

（二）复苏1. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。2. 培养液（DMEM）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。

3. 二甲基亚砜（DMSO）在40C冰箱中冷藏30min，备用。4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。

5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min,5min）。6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。

7. 记录复苏日期。【注意事项】1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。

此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。

如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。3. 离心前须加入少量培养液。

细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。4. 离心问题：目前主要有两种见解。

一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大， 死亡。

此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO）,DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。

我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml-15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响 细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1%。

所以如果你的冻存液的浓度是 10%DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

5.心肺复苏基本步骤和注意事项

楼主你好；

心肺复苏ABC步骤；

A 开放气道

拍摇患者并大声询问，手指甲掐压人中穴约五秒，如无反应表示意识丧失。这时应使患者水平仰卧，解开颈部钮扣，注意清除口腔异物，使患者仰头抬颏，用耳贴近口鼻，如未感到有气流或胸部无起伏，则表示已无呼吸。

B 口对口人工 呼吸

在保持患者仰头抬颏前提下，施救者用一手捏闭的鼻孔 （或口唇 ），然后深吸一大口气，迅速用力向患者口 （或鼻 ）内吹 气 ， 然后放松鼻孔（或口唇），照此每5秒钟反复一次，直到恢复自主呼吸。

每次吹气间隔1.5秒，在这个时间抢救者应自己深呼吸一次，以便继续口对口呼吸，直至专业抢救人员的到来。

C 人工循环

检查心脏是否跳动，最简易、最可靠的是颈动脉。抢救者用2-3个手指放在患者气管与颈部肌肉间轻轻按压，时间不少于10秒。

如患者停止心跳，抢救者应握紧拳头，拳眼向上，快速有力猛击患者胸骨正中下段一次。此举有可能使患者心脏复跳，如一次不成功可按上述要求再次扣击一次。

如心脏不能复跳，就要通过胸外按压，使心脏和大血管血液产生流动。以维持心、脑等主要器官最低血液需要量。

选择胸外心脏按压部位：先以右手的中指、示指定出肋骨下缘，而后将右手掌侧放在胸骨下1/3，再将左手放在胸骨上方，左手拇指邻近右手指，使左手掌底部在剑突上。右手置于左手上，手指间互相交错或伸展。按压力量经手跟而向下，手指应抬离胸部。

·胸外心脏按压方法：急救者两臂位于病人胸骨的正上方，双肘关节伸直，利用上身重量垂直下压，对中等体重的成人下压深度为3—4厘米，而后迅速放松，解除压力，让胸廓自行复位。如此有节奏地反复进行，按压与放松时间大致相等，频率为每分钟80—100次。

一人心肺复苏方法：当只有一个急救者给病人进行心肺复苏术时，应是每做30次胸心脏按压，交替行2次人工呼吸。

二人心肺复苏方法：当有两个急救者给病人进行心肺复苏术时，首先两个人应呈对产位置，以便于互相交换。此时，一个人做胸外心脏按压；另一个人做人工呼吸。两人可以数着1、2、3进行配合，每按压心脏30次，口对口或口对鼻人工呼吸2次。）

注意事项 ；

1、口对口吹气量不宜过大，一般不超过1200毫升，胸廓稍起伏即可。吹气时间不宜过长，过长会引起急性胃扩张、胃胀气和呕吐。吹气过程要注意观察患（伤）者气道是否通畅，胸廓是否被吹起。

2、胸外心脏按术只能在患（伤）者心脏停止跳动下才能施行。

3、口对口吹气和胸外心脏按压应同时进行，严格按吹气和按压的比例操作，吹气和按压的次数过多和过少均会影响复苏的成败。

4、胸外心脏按压的位置必须准确。不准确容易损伤其他脏器。按压的力度要适宜，过大过猛容易使胸骨骨折，引起气胸血胸；按压的力度过轻，胸腔压力小，不足以推动血液循环。

5、施行心肺复苏术时应将患（伤）者的衣扣及裤带解松，以免引起内脏损伤。

2005年底美国心脏学会（AHA）发布了新版CPR急救指南，与旧版指南相比，主要就是按压与呼吸的频次由15:2调整为30:2

6.A549细胞的复苏方法

1.先从液氮罐内迅速拿出需要复苏的细胞，迅速放入37摄氏度的水浴中，并不停的摇晃，注意瓶口不要碰到水面，以防污染细胞；

2.将盛入37摄氏度水浴中的细胞连同烧杯一起带入细胞房，待细胞均匀融化后，拿出；

3.将细胞悬液倒入离心管，加入3-4滴完全培养基，放入离心机中离心1500转（调两档），3-4min，观察细胞沉淀情况，如果太少，再次离心3-4min;

4.将离心管拿出，倒掉上清液，在离心管中加入2滴培养液，并用弯头滴管伸入液面以下不断吹打（注意不要将弯头伸出液面，以防有气泡产生，影响细胞生长）；

5.将新的细胞培养瓶中加入两滴管培养液，再将离心管中的细胞转入新的细胞培养瓶（以防加入时产生气泡）并使细胞散步均匀；

6.用酒精擦拭瓶身，显微镜观察细胞形态（有透明的圆的细胞漂浮其中），培养瓶上写明日期及培养细胞的名称；

7.将培养瓶的盖子稍松，放入CO2培养（便于CO2进入）待第二天观察（细胞一般4小时贴壁）；