氧核糖核酸(英语:Deoxyribonucleic acid,缩写为DNA)又称去氧核糖核酸,是一种分子,可组成遗传指令,以引导生物发育与生命机能运作。主要功能是长期性的资讯储存,可比喻为“蓝图”或“食谱”[1]。其中包含的指令,是建构细胞内其他的化合物,如蛋白质与RNA所需。带有遗传讯息的DNA片段称为基因,其他的DNA序列,有些直接以自身构造发挥作用,有些则参与调控遗传讯息的表现。
DNA是一种长链聚合物,组成单位称为核苷酸,而糖类与磷酸分子借由酯键相连,组成其长链骨架。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相接,这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列,可组成遗传密码,是蛋白质氨基酸序列合成的依据。读取密码的过程称为转录,是根据DNA序列复制出一段称为RNA的核酸分子。多数RNA带有合成蛋白质的讯息,另有一些本身就拥有特殊功能,例如rRNA、snRNA与siRNA。
在细胞内,DNA能组织成染色体结构,整组染色体则统称为基因组。染色体在细胞分裂之前会先行复制,此过程称为DNA复制。对真核生物,如动物、植物及真菌而言,染色体是存放于细胞核内;对于原核生物而言,如细菌,则是存放在细胞质中的类核里。染色体上的染色质蛋白,如组织蛋白,能够将DNA组织并压缩,以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用,进而调节基因的转录。
DNA有多种不同的构象,其中有些构象之间在构造上的差异并不大。目前已辨识出来的构象包括:A-DNA、B-DNA、C-DNA、D-DNA[47]、E-DNA[48]、H-DNA[49]、L-DNA[47]、P-DNA[50]与Z-DNA[26][51]。不过以现有的生物系统来说,自然界中可见的只有A-DNA、B-DNA与Z-DNA。DNA所具有的构象可根据DNA序列、超螺旋的程度与方向、碱基上的化学修饰,以及溶液状态,如金属离子与多胺浓度来分类[52]。三种主要构象中以B型为细胞中最常见的类型[53],与另两种DNA双螺旋的差异,在于其几何形态与尺寸。
A-DNA又称A型DNA,为DNA双螺旋的一种形式,拥有与较普遍的B-DNA相似的右旋结构,但其螺旋较短较紧密。A-DNA是三种具有生物活性的DNA双螺旋结构,另两种则为B-DNA及Z-DNA。一般只有脱水的DNA样本中才会出现,可用来作晶体学实验。此外当DNA与RNA混合配对时,也可能出现A-DNA形式的螺旋。
是这些内容吧——
1.DNA的结构
(1)DNA的化学组成
(元素组成:C、H、O、N、P。)
①组成DNA的基本单位是脱氧核苷酸,它由一个脱氧苷糖、一个磷酸和一个含氮碱基组成。
②组成DNA的碱基有四种:腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T);有四种脱氧核苷酸:腺嘌呤脱氧核苷酸,鸟嘌呤脱氧核苷酸,胞嘧啶脱氧核苷酸,胸腺嘧啶脱氧核苷酸。DNA的每一条链由四种不同的脱氧核苷酸聚合而成多脱氧核苷酸链。
(2)DNA分子的立体结构
结构的主要特点是:
①两条长链按反向平行方式盘旋成双螺旋结构。
②脱氧核糖和磷酸交替连接,排列在DNA分子的外侧,构成基本骨架,碱基排列在内侧。
③碱基互补配对原则:
两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对,且碱基配对有一定的规律:A—T、G—C(A一定与T配对,G一定与C配对)。
(3)DNA的特性
①稳定性:DNA分子两条长链上的脱氧核糖与Pi交替排列的顺序和两条链之间碱基互补配对的方式是稳定不变的,从而导致DAN分子的稳定性。
②多样性:DNA分子中碱基相互配对的方式虽然不变,而长链中的碱基对的排列顺序是千变万化的。如一个最短的DNA分子大约有4000个碱基对,这些碱基对可能的排列方式就有2的4000次方种。实际上构成DNA分子的脱氧核苷酸数目是成千上万的,其排列种类几乎是无限的,这就构成DNA分子的多样性。
③特异性:每个特定的DNA分子都具有特定的碱基排列顺序,这种特定的碱基排列顺序就构成了DNA分子自身严格的特异性。
2.DNA的复制
(1)复制的概念
在细胞有丝分裂和减数第一次分裂的间期,以母细胞DNA分子为模板,合成子代DNA的过程。DNA的复制实质上是遗传信息的复制。
(2)“准确”复制的原理
①DNA具有独特的双螺旋结构,能为复制提供模板;
②碱基具有互补配对的能力,能够使复制准确无误。
(3)DNA复制的过程
复制的过程大致可归纳为如下三点:
①解旋提供准确模板:在ATP供能、解旋酶的作用下,DNA分子两条多脱氧核苷酸链配对的碱基从氢键处断裂,两条螺旋的双链解开,这个过程叫做解旋。解开的两条单链叫母链(模板链)。
②合成互补子链:以上述解开的每一段母链为模板,以周围环境中游离的4种脱氧核苷酸为原料,按照碱基互补配对原则,在有关酶的作用下,各自合成与母链互补的一段子链。
③子、母链结合盘绕形成新DNA分子:在DNA聚合酶的作用下,随着解旋过程的进行,新合成的子链不断地延伸,同时每条子链与其对应的母链盘绕成双螺旋结构,从而各自形成一个新的DNA分子,这样,1DNA分子→2个完全相同的DNA分子。
(4)DNA复制的特点
①DNA分子是边解旋边复制的,是一种半保留式复制,即在子代双链中,有一条是亲代原有的链,另一条(子链)则是新合成的。
②DNA复制严格遵守碱基互补配对原则准确复制。从而保证了子代和亲代具有相同的遗传性状。
(5)DNA复制的必需条件
DNA复制时必需条件是亲代DNA的两条母链提供准确模板、四种脱氧核苷酸为原料、能量(ATP)和一系列的酶,缺少其中任何一种,DNA复制都无法进行。
(6)DNA复制的生物学意义
DNA通过复制,使遗传信息从亲代传给了子代,从而保证了物种的相对稳定性,保持了遗传信息的连续性,使种族得以延续。
是这些内容吧—— 1.DNA的结构 (1)DNA的化学组成 (元素组成:C、H、O、N、P。)
①组成DNA的基本单位是脱氧核苷酸,它由一个脱氧苷糖、一个磷酸和一个含氮碱基组成。 ②组成DNA的碱基有四种:腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T);有四种脱氧核苷酸:腺嘌呤脱氧核苷酸,鸟嘌呤脱氧核苷酸,胞嘧啶脱氧核苷酸,胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
DNA的每一条链由四种不同的脱氧核苷酸聚合而成多脱氧核苷酸链。 (2)DNA分子的立体结构 结构的主要特点是: ①两条长链按反向平行方式盘旋成双螺旋结构。
②脱氧核糖和磷酸交替连接,排列在DNA分子的外侧,构成基本骨架,碱基排列在内侧。 ③碱基互补配对原则: 两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对,且碱基配对有一定的规律:A—T、G—C(A一定与T配对,G一定与C配对)。
(3)DNA的特性 ①稳定性:DNA分子两条长链上的脱氧核糖与Pi交替排列的顺序和两条链之间碱基互补配对的方式是稳定不变的,从而导致DAN分子的稳定性。 ②多样性:DNA分子中碱基相互配对的方式虽然不变,而长链中的碱基对的排列顺序是千变万化的。
如一个最短的DNA分子大约有4000个碱基对,这些碱基对可能的排列方式就有2的4000次方种。实际上构成DNA分子的脱氧核苷酸数目是成千上万的,其排列种类几乎是无限的,这就构成DNA分子的多样性。
③特异性:每个特定的DNA分子都具有特定的碱基排列顺序,这种特定的碱基排列顺序就构成了DNA分子自身严格的特异性。 2.DNA的复制 (1)复制的概念 在细胞有丝分裂和减数第一次分裂的间期,以母细胞DNA分子为模板,合成子代DNA的过程。
DNA的复制实质上是遗传信息的复制。 (2)“准确”复制的原理 ①DNA具有独特的双螺旋结构,能为复制提供模板; ②碱基具有互补配对的能力,能够使复制准确无误。
(3)DNA复制的过程 复制的过程大致可归纳为如下三点: ①解旋提供准确模板:在ATP供能、解旋酶的作用下,DNA分子两条多脱氧核苷酸链配对的碱基从氢键处断裂,两条螺旋的双链解开,这个过程叫做解旋。解开的两条单链叫母链(模板链)。
②合成互补子链:以上述解开的每一段母链为模板,以周围环境中游离的4种脱氧核苷酸为原料,按照碱基互补配对原则,在有关酶的作用下,各自合成与母链互补的一段子链。 ③子、母链结合盘绕形成新DNA分子:在DNA聚合酶的作用下,随着解旋过程的进行,新合成的子链不断地延伸,同时每条子链与其对应的母链盘绕成双螺旋结构,从而各自形成一个新的DNA分子,这样,1DNA分子→2个完全相同的DNA分子。
(4)DNA复制的特点 ①DNA分子是边解旋边复制的,是一种半保留式复制,即在子代双链中,有一条是亲代原有的链,另一条(子链)则是新合成的。 ②DNA复制严格遵守碱基互补配对原则准确复制。
从而保证了子代和亲代具有相同的遗传性状。 (5)DNA复制的必需条件 DNA复制时必需条件是亲代DNA的两条母链提供准确模板、四种脱氧核苷酸为原料、能量(ATP)和一系列的酶,缺少其中任何一种,DNA复制都无法进行。
(6)DNA复制的生物学意义 DNA通过复制,使遗传信息从亲代传给了子代,从而保证了物种的相对稳定性,保持了遗传信息的连续性,使种族得以延续。
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提取DNA主要有SDS和CTAB法,其实提取效果的好坏主要看提取的对象是什么样的材料,在提取之前一定要好好分析材料的特性,然后在设计实验步骤。
一)CTAB法
CTAB是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇。
(二)SDS法
利用高浓度的SDS,在较高温度(55—65℃)条件下裂解细胞,使染色体离析,蛋白质变性,释放出核酸,然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀(最常用的是加入5M的KAc于冰上保温,在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物),离心除去沉淀后,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
以下是在提取热带水果DNA时设计的两种不同方法步骤,对比起来CTAB法好,在禾本科植物效果差不多!
1、CTAB法
1) 在所需量的CTAB抽提液中加入2-巯基乙醇,使终浓度达2%(v/v)。将此溶液预热至65℃。
对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2-ME/CTAB抽提液。
2) 用液氮(-196℃)或干冰(-78℃)冷却粉碎器/匀浆器,将0.5 g植物组织粉碎成细粉,然后将组织转移到2.0 ml离心管。
3) 加入800 µl预热的2-Me/CTAB,混合使之充分湿润,于65℃温育20 min,不时颠倒混匀。
4) 待冷至室温后,加入800 µl氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混匀至溶液呈乳浊状----但不要振荡。25℃,10000 rpm离心10 min。
5) 上清(~700 µl)转移至另一干净的离心管中,加入5 µl RNaseA贮液,37℃温育30 min。
6) 加入700 µl氯仿/异戊醇,颠倒混匀,25℃,10000 rpm离心10 min。
7) 上清(~600 µl)转移至另一干净的1.5 ml离心管中,加入600 µl异丙醇,颠倒混匀,室温或-20℃放置20 min。
8) 25℃,12000 rpm,离心10 min,收集沉淀。
9) 去上清,加1 ml70%乙醇洗涤沉淀两次。(25℃,12000 rpm,离心10 min)
10)凉干DNA,溶于50 µl ddH2O,4℃保存备用。
2、SDS法
① 将0.3 g植物材料于液氮速冻,然后在研钵中将其磨碎,将粉末转至2 ml离心管中。
② 加入1.2 ml预热至65℃的提取缓冲液(其中加入3 μl β—巯基乙醇,增加DNA的稳定性),置65℃水浴中放置30分钟,不时颠倒混匀。
③ 加入0.45 ml 5M的醋酸钾,混匀,冰浴20分钟,在10000 rpm离心20 min。需要的话,Miracloth纱布过滤除去沉淀,上清液转入另一离心管中。
④ 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀,12000 rpm离心15 min。
⑤ 转移上清液到另一新离心管中,加5 μl RNaseA贮液,37℃温育30 min。
⑥ 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀,12000 rpm离心15 min。
⑦ 转移上清液到另一新离心管中,加入0.7V异丙醇,轻轻颠倒混匀,-20℃放置30分钟沉淀核酸。
⑧ 25℃,12000 rpm,离心10 min,收集沉淀。
⑨ 弃上清,70%乙醇洗两次。
⑩ 凉干DNA,溶于50 µl ddH2O,4℃保存备用。
1、DNA提取把样本细胞核中所含有DNA提取出来,然后进行一定的纯化,化除样本中的杂质。
2、PCR扩增PCR的中文名为聚合酶链式反应,简单的说,PCR扩增这一步就是把我们所需要的片段通过酶促反应,在PCR仪上进行大量复制,放大到通过某些专用仪器可以看到的程度。 3、后PCR反应这一步主要是上ABI测序仪检测的准备阶段,将双链的DNA打开,加一些检测用的的内标,主要是用来标记检测的片段长度。
4、毛细管测序仪检测由于DNA带有电荷,通过毛细管电泳的方法,不同片段DNA长度的电泳速度不同,在同样的电压,同样的电泳时间下,泳动的距离不同,这些长短不同距离可以通过前期加入的内标测量分辨出来,同时可通过一定的软件显示在电脑上,方便检测人员处理和分析数据。 5、分析数据,出具报告主要是检测人员将所得结果进行分析汇总、计算,然后出鉴定结论和报告。
根据人和净化多年的净化工程经验,DNA实验室装修主要要注意以下几个问题:
一、水路问题:上水的施工要考虑的是安全和科学还有适用。走上水时,要根据具体实验来选择材料也就是上水管和接头。还要考虑水电的分离、水管周围的环境、水路的走向等等。实验室的下水一般比较麻烦,因为实验室的下水规范要求和实际国情,还有具体的实验室或实验楼环境有很大的出入。
二、电路问题:实验室的用电是一项很重要的问题,弱电、照明电、安全电和实验设备用电。其中实验室仪器设备用电为主要重点,因为实验室的仪器设备特别是一些精密仪器,这些仪器设备的原理大都是洛伦兹力原理的作用和反作用,也就是通过电流的微变化,来控制数据的变化。实验室仪器设备用电,我们所要解决的问题就是,控制和降低电流的变化浮动、减少或稳定谐波的变化数值、减少或降低磁场的干扰等等。
三、排风系统问题:实验室的排风主要是解决实验人员的安全和实验室环境的需要。实验室的排送风主要是考虑什么环境需要正压和负压还有恒压。具体的配置要看,实验室的具体性质,来安排正负压的大小。实验室的排送风,不像普通的办公换风。它的风路和引导气体走向有很严格的要求,解决不好就会产生气体回流及气体排不出去,或排风量很大实验室内气味仍然存在,达不到换风的效果。实验室的具体性质不同,所要求的正负压不同,风量和换风次数也不同。实验室的具体性质不同,所要达到的相对换风和绝对换风也是有着很大的差异。
四、最后实验室的材料选择也很重要,要根据不同的实验性质,来选择不同的材料去适应实验室特殊的环境。如腐蚀也要看是酸性的,还是碱性,还是有机物的。当然还要考虑到实验室的高温和低温环境。有些实验区域可能还会考虑到材料的变形、老化、阻燃、辐射等情况。
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