色谱题库(介绍高效液相色谱法入门知识)

1.介绍高效液相色谱法入门知识

楼主，您好。

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入进样阀的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。

采用微柱液相色谱系统可以减少溶剂的消耗并达到快速分离之目的。 高效液相色谱法的主要分离机制有吸附、分配、离子交换和排阻作用。

1.对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。

（1）色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等）也有使用。

正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。

填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等因素）以及色谱柱的填充，将直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在150？以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在300？以上的填料。

以硅胶为载体的键合固定相填充剂适用pH2~8的流动相。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。

当色谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。 （2）检测器 最常用的检测器为紫外吸收检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测物的质量有关，还与化合物的结构有关；示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物结构均有响应；蒸发光散射检测器属质量型检测器，对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱管制和色谱峰纯度的检查。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测物的质量呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测物的质量通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。

不同的检测器，对流动相的要求不同。当采用紫外检测器时，所用流动相应至少符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。

蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。 （3）流动相 由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常不应低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。

正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求，可在该品种项下注明。

2.系统适用性试验 色谱中最难分离物质对或与其相关的物质对的分离度和待测物响应值的重复性是系统适用性试验的重要参数。 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整，应符合要求；或规定色谱条件下的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。

（1）色谱柱的理论板数（n） 在规定的色谱的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽（Wh/2），按n=5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的效果等），使理论板数符合要求。 （2）分离度定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。

分离度（R）的计算公式为： 式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的峰宽。 除另有规定外，分离度应大于1.5。

(3)重复性 取各品种项下的对照溶液，连续进样3~5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项。

2.气相色谱的专业知识

1 气相色谱 气相色谱是一种以气体为流动相的柱色谱法，根据所用固定相状态的不同可分为气-固色谱（GSC）和气-液色谱（GLC）。

2 气相色谱原理 气相色谱的流动相为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。

吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。

3 气相色谱流程 载气由高压钢瓶中流出，经减压阀降压到所需压力后，通过净化干燥管使载气净化，再经稳压阀和转子流量计后，以稳定的压力、恒定的速度流经气化室与气化的样品混合，将样品气体带入色谱柱中进行分离。分离后的各组分随着载气先后流入检测器，然后载气放空。

检测器将物质的浓度或质量的变化转变为一定的电信号，经放大后在记录仪上记录下来，就得到色谱流出曲线。根据色谱流出曲线上得到的每个峰的保留时间，可以进行定性分析，根据峰面积或峰高的大小，可以进行定量分析。

4 气相色谱仪 由以下五大系统组成：气路系统、进样系统、分离系统、温控系统、检测记录系统。组分能否分开，关键在于色谱柱；分离后组分能否鉴定出来则在于检测器，所以分离系统和检测系统是仪器的核心。

5 气相色谱仪几种常用检测器 目前有很多种检测器，其中常用的检测器是：氢火焰离子化检测器（FID） 热导检测器（TCD） 氮磷检测器 （NPD）火焰光度检测器（FPD） 电子捕获检测器（ECD）等类型。氢火焰离子化检测器（FID）：（氢）火焰离子化检测器是根据气体的导电率是与该气体中所含带电离子的浓度呈正比这一事实而设计的。

一般情况下，组分蒸汽不导电，但在能源作用下，组分蒸汽可被电离生成带电离子而导电。工作原理：由色谱柱流出的载气（样品）流经温度高达2100℃的氢火焰时，待测有机物组分在火焰中发生离子化作用，使两个电极之间出现一定量的正、负离子，在电场的作用下，正、负离子各被相应电极所收集。

当载气中不含待测物时，火焰中离子很少，即基流很小，约10-14A。当待测有机物通过检测器时，火焰中电离的离子增多，电流增大（但很微弱10-8~10-12A）。

需经高电阻（108~l011）后得到较大的电压信号，再由放大器放大，才能在记录仪上显示出足够大的色谱峰。该电流的大小，在一定范围内与单位时间内进入检测器的待测组分的质量成正比，所以火焰离子化检测器是质量型检测器。

火焰离子化检测器对电离势低于H2的有机物产生响应，而对无机物、久性气体和水基本上无响应，所以火焰离子化检测器只能分析有机物（含碳化合物），不适于分析惰性气体、空气、水、CO、CO2、CS2、NO、SO2及H2S等。热导检测器（TCD）：热导检测器（TCD）又称热导池或热丝检热器，是气相色谱法最常用的一种检测器。

基于不同组分与载气有不同的热导率的原理而工作的热传导检测器。工作原理：热导检测器的工作原理是基于不同气体具有不同的热导率。

热丝具有电阻随温度变化的特性。当有一恒定直流电通过热导池时，热丝被加热。

由于载气的热传导作用使热丝的一部分热量被载气带走，一部分传给池体。当热丝产生的热量与散失热量达到平衡时，热丝温度就稳定在一定数值。

此时，热丝阻值也稳定在一定数值。由于参比池和测量池通入的都是纯载气，同一种载气有相同的热导率，因此两臂的电阻值相同，电桥平衡，无信号输出，记录系统记录的是一条直线。

当有试样进入检测器时，纯载气流经参比池，载气携带着组分气流经测量池，由于载气和待测量组分二元混合气体的热导率和纯载气的热导率不同，测量池中散热情况因而发生变化，使参比池和测量池孔中热丝电阻值之间产生了差异，电桥失去平衡，检测器有电压信号输出，记录仪画出相应组分的色谱峰。载气中待测组分的浓度越大，测量池中气体热导率改变就越显著，温度和电阻值改变也越显著，电压信号就越强。

此时输出的电压信号与样品的浓度成正比，这正是热导检测器的定量基础。热导池（TCD）检测器是一种通用的非破坏性浓度型检测器，一直是实际工作中应用最多的气相色谱检测器之一。

TCD特别适用于气体混合物的分析，对于那些氢火焰离子化检测器不能直接检测的无机气体的分析，TCD更是显示出独到之处。TCD在检测过程中不破坏被监测组份，有利于样品的收集，或与其他仪器联用。

TCD能满足工业分析中峰高定量的要求，很适于工厂的控制分析。氮磷检测器 （NPD）：氮磷检测器（NPD）是一种质量检测器，适用于分析氮，磷化合物的高灵敏度、高选择性检测器。

它具有与FID相似的结构，只是将一种涂有碱金属盐如Na2SiO3,Rb2SiO3类化合物的陶瓷珠，放置在燃烧的氢火焰和收集极之间，当试样蒸气和氢气流通过碱金属盐表面时，含氮、磷的化合物便会从被还原的碱金属蒸气上获得电子，失去电子的碱金属形成盐再沉积到陶瓷珠的表面上。工作。