中药指纹图谱的测定方法(目前,中药指纹图谱技术有哪几种使用方法)

1.目前,中药指纹图谱技术有哪几种使用方法

目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描（TLCS）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和高效毛细管电泳法（HPCE）等色谱法以及紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、质谱法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射线衍射法等光谱法。

其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点；中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。

因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC—MS和GC—MS等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。

2.中药指纹图谱的分析、技术

随着分离分析技术的发展，中药质量研究也由过去“四大鉴别”（基元鉴别、性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别）发展到反映中药材全貌的指纹体系，即反映中药材的多元化学组成特性的化学指纹图谱和反映生物体 （除矿物、树脂类外） 特性的基因指纹图谱，从有效成分和遗传物质两方面实现对中药材的质量控制，为中药材以及中成药提供综合的和可量化的质量评价方法。

中国中药指纹图谱的研究已有相当的基础，最早可以追溯到20世纪60年代，如采用薄层色谱、紫外光谱、红外光谱法来描述中药材主要成分的特征，这是早期的原始的指纹图谱，具有直观、在简单情况下容易比较差异的优点。随着分析技术的飞速发展和微电脑的广泛应用，基于化学计量法的中药指纹图谱的研究方法向高效、灵敏、专属、智能化、联用型的方向发展，高效液相、高效毛细管电泳、高速逆流色谱、核磁共振、近红外光谱等新兴分析技术的应用和各种数学分析方法的运用，为中药指纹图谱的研究与发展提供了广阔的前景。

紫外光谱指纹图谱紫外光谱法是1995年以前指纹图谱常用的方法。由于不同中药所含的不饱和程度有差异，因而导致其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度亦有差异，以此达到鉴别效果。

常用导数光谱及结合各种数学分析法来消除样品中的一些无关吸收，排除原图谱中的某些干扰。红外光谱（IR ）指纹图谱红外光谱又称分子振动转动光谱，是一种分子吸收光谱。

当样品受到频率连续变化的红外光照射时，分子吸收了某些频率的辐射，并由其振动或转动运动引起偶极矩的净变化，产生分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁，使相应于这些吸收区域的透射光强度减弱。记录红外光的百分透射与波数或波长关系的曲线，就得到红外光谱。

一般的红外光谱是对整个化合物分子的鉴别，比单纯的官能团的化学定性鉴别专一性更强。而中药材的红外光谱在本质上与纯化合物红外光谱不同，它是混合物中各个组分红外光谱的叠加。

中药材各种化学成分只要在质和量的方面相对稳定，并且样品处理方法按同一要求进行，则其红外光谱也是应该相对稳定的。因此这样得到的混合物红外光谱应该是具有一定的客观性和可重复性。

利用上述原理，不同混合物的红外光谱各主要吸收峰归属，只要在4000-400cm，范围内比较光谱差异即可。这种差异可以表现在三个方面：一是在某一波数处鉴别双方只有一方有明显差异；二是在某一波数内，鉴别双方的光谱中，吸收峰的形状和强度都有明显差异；三是“指纹区”，面貌不同。

近红外光谱法近红外光谱法（NIRS）是一种用于鉴定有机物质十分有用的技术，是中红外光谱中C-H, N-H,O-H和S-H的共振吸收，具有高信息量。波长范围为780nm-2500nm，而且该光谱取决于粒子大小、多晶型、残留溶剂、湿度等等因素。

因此待测物光谱的鉴定不可能直接与参比物质光谱比较后确定，需要通过一系列样本的检测（必须预先知道样本中相关成分的含量或样本的定性归属），运用化学计算学手段，建立样本与信息之间的数学模型。运用该模型即可以对未知样本（例如新近购进的原药材或新生产的成品等）进行辨别分析（给出结果：合格与否、含量多少等）。

该方法为非破坏性方法，可实现产品的无损检测，具有检测速度快，操作简单，所需样品少，适宜于液体、固体、粘稠流体的分析及过程控制等优点。但是在进行定性定量分析中必须采用一定的数据处理，需要掌握一定的化学计量知识。

荧光光谱中药注射剂常含荧光性物质，但因不同注射剂所含具体荧光性物质不同，同种注射剂又因厂家的具体配方的差异或制备工艺条件的波动，均会使其特征的荧光激发、发射光谱不同或其强度呈现差异；根据注射剂的荧光图谱的差异达到快速鉴别、认定和控制配方、工艺的目的。荧光光谱不像红外光谱那样具有明显的指纹特征，但具有高灵敏度的显著优势，且差异更为一目了然，易于判断，因此，可以作为红外光谱指纹技术的一种补充，用于中药注射液的鉴别和认定，以及生产工艺的控制和成药热稳定性研究等。

色谱指纹图谱最实用、应用也是最广泛。中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。

色谱指纹图谱最大的优点是具有分离的功能。薄层色谱（TLC）指纹图谱TLC为传统的定性、半定量分析方法，在中国“七五”、十一五”及“九五”公关课题中有大量采用薄层色谱法进行地道药材的定性鉴别。

该法操作简单、分析速度快速、一次分析样品多，提供信息量大，用固定波长对薄层展开的各个斑点进行扫描，所得扫描图谱比目测的层析图谱更加客观准确，因此具有较好的指纹鉴别意义。其最大的缺点是重现性以及精密度差，所以在指纹图谱应用中受到限制，但可以作为中药指纹图谱研究的借鉴和补充。

气相色谱（GC）指纹图谱中药指纹图谱技术GC最适合于各种主含易挥发性成分药材及其制剂的分析，尤其是毛细管气相色谱法，分辨率很高，往往一个色谱可以分出百个成分。该法灵敏度高、分离度好，分析速度快，但是分析范围只是局限于低沸点成分，是指纹图谱研。

3.中药指纹图谱的分析、技术

随着分离分析技术的发展，中药质量研究也由过去“四大鉴别”（基元鉴别、性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别）发展到反映中药材全貌的指纹体系，即反映中药材的多元化学组成特性的化学指纹图谱和反映生物体 （除矿物、树脂类外） 特性的基因指纹图谱，从有效成分和遗传物质两方面实现对中药材的质量控制，为中药材以及中成药提供综合的和可量化的质量评价方法。

中国中药指纹图谱的研究已有相当的基础，最早可以追溯到20世纪60年代，如采用薄层色谱、紫外光谱、红外光谱法来描述中药材主要成分的特征，这是早期的原始的指纹图谱，具有直观、在简单情况下容易比较差异的优点。随着分析技术的飞速发展和微电脑的广泛应用，基于化学计量法的中药指纹图谱的研究方法向高效、灵敏、专属、智能化、联用型的方向发展，高效液相、高效毛细管电泳、高速逆流色谱、核磁共振、近红外光谱等新兴分析技术的应用和各种数学分析方法的运用，为中药指纹图谱的研究与发展提供了广阔的前景。

紫外光谱指纹图谱紫外光谱法是1995年以前指纹图谱常用的方法。由于不同中药所含的不饱和程度有差异，因而导致其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度亦有差异，以此达到鉴别效果。

常用导数光谱及结合各种数学分析法来消除样品中的一些无关吸收，排除原图谱中的某些干扰。红外光谱（IR ）指纹图谱红外光谱又称分子振动转动光谱，是一种分子吸收光谱。

当样品受到频率连续变化的红外光照射时，分子吸收了某些频率的辐射，并由其振动或转动运动引起偶极矩的净变化，产生分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁，使相应于这些吸收区域的透射光强度减弱。记录红外光的百分透射与波数或波长关系的曲线，就得到红外光谱。

一般的红外光谱是对整个化合物分子的鉴别，比单纯的官能团的化学定性鉴别专一性更强。而中药材的红外光谱在本质上与纯化合物红外光谱不同，它是混合物中各个组分红外光谱的叠加。

中药材各种化学成分只要在质和量的方面相对稳定，并且样品处理方法按同一要求进行，则其红外光谱也是应该相对稳定的。因此这样得到的混合物红外光谱应该是具有一定的客观性和可重复性。

利用上述原理，不同混合物的红外光谱各主要吸收峰归属，只要在4000-400cm，范围内比较光谱差异即可。这种差异可以表现在三个方面：一是在某一波数处鉴别双方只有一方有明显差异；二是在某一波数内，鉴别双方的光谱中，吸收峰的形状和强度都有明显差异；三是“指纹区”，面貌不同。

近红外光谱法近红外光谱法（NIRS）是一种用于鉴定有机物质十分有用的技术，是中红外光谱中C-H, N-H,O-H和S-H的共振吸收，具有高信息量。波长范围为780nm-2500nm，而且该光谱取决于粒子大小、多晶型、残留溶剂、湿度等等因素。

因此待测物光谱的鉴定不可能直接与参比物质光谱比较后确定，需要通过一系列样本的检测（必须预先知道样本中相关成分的含量或样本的定性归属），运用化学计算学手段，建立样本与信息之间的数学模型。运用该模型即可以对未知样本（例如新近购进的原药材或新生产的成品等）进行辨别分析（给出结果：合格与否、含量多少等）。

该方法为非破坏性方法，可实现产品的无损检测，具有检测速度快，操作简单，所需样品少，适宜于液体、固体、粘稠流体的分析及过程控制等优点。但是在进行定性定量分析中必须采用一定的数据处理，需要掌握一定的化学计量知识。

荧光光谱中药注射剂常含荧光性物质，但因不同注射剂所含具体荧光性物质不同，同种注射剂又因厂家的具体配方的差异或制备工艺条件的波动，均会使其特征的荧光激发、发射光谱不同或其强度呈现差异；根据注射剂的荧光图谱的差异达到快速鉴别、认定和控制配方、工艺的目的。荧光光谱不像红外光谱那样具有明显的指纹特征，但具有高灵敏度的显著优势，且差异更为一目了然，易于判断，因此，可以作为红外光谱指纹技术的一种补充，用于中药注射液的鉴别和认定，以及生产工艺的控制和成药热稳定性研究等。

色谱指纹图谱最实用、应用也是最广泛。中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。

色谱指纹图谱最大的优点是具有分离的功能。薄层色谱（TLC）指纹图谱TLC为传统的定性、半定量分析方法，在中国“七五”、十一五”及“九五”公关课题中有大量采用薄层色谱法进行地道药材的定性鉴别。

该法操作简单、分析速度快速、一次分析样品多，提供信息量大，用固定波长对薄层展开的各个斑点进行扫描，所得扫描图谱比目测的层析图谱更加客观准确，因此具有较好的指纹鉴别意义。其最大的缺点是重现性以及精密度差，所以在指纹图谱应用中受到限制，但可以作为中药指纹图谱研究的借鉴和补充。

气相色谱（GC）指纹图谱中药指纹图谱技术GC最适合于各种主含易挥发性成分药材及其制剂的分析，尤其是毛细管气相色谱法，分辨率很高，往往一个色谱可以分出百个成分。该法灵敏度高、分离度好，分析速度快，但是分析范围只是局限于低沸点成分，是指纹图谱研。

4.中药指纹图谱的构建方法

目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描（TLCS）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和高效毛细管电泳法（HPCE）等色谱法以及紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、质谱法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射线衍射法等光谱法。

其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点；中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。

因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC— MS和GC—MS等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。

1 薄层色谱法（TLC） 薄层色谱具有选用范围广，重现性好等优点，常用于中药各种成分的鉴别。用固定波长对薄层展开的各斑点作薄层扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确，因而具有更好的指纹鉴别意义。

但由于受薄层板的质量和开放式层析系统等外界因素的影响，易引起一定的实验误差。2 气相色谱法 （GC） 气相色谱是封闭性色谱，受外界影响较少，具有高性能、高选择性、高灵敏度等优点，适合于药材及制剂中挥发性成分指纹图谱的研究。

一般使用质量型检测器-氢火焰离子化检测器（FID）。钱浩泉等[5]用气相色谱法建立了高良姜及其边缘植物挥发油成分的指纹图谱。

具体应用中多与质谱联用，不仅具有 GC 的高分离效能，而且兼备了质谱鉴定的高灵敏度和准确性。3 高效液相色谱法 （HPLC） 高效液相色谱具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点。

不受样品挥发度和热稳定性的限制，比气相色谱法应用范围更广，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建指纹图谱的主要方法之一。由于中药成分的复杂性，构建指纹图谱一般采用梯度洗脱，因为逐步提高流动相洗脱能力可获得较多色谱峰，提供更多指纹信息。

在考察条件时，要对指标成分和非指标成分都予以考虑，由于药材中各种成分的吸收波长及对不同检测器的响应不同，在构建指纹图谱时也需要加以考虑。实际应用中多使用多种联用技术，充分利用各检测器的互补性，从不同角度反映药材及制剂的全貌，从各种图谱中得到结构信息。

4 高速逆流色谱法 （HSCCC） 它是目前国际上较新型的液-液分配色谱技术，利用相对移动的两种互不相溶溶剂，在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的组分分离。已有报道[6]将 HSCCC应用于生物碱、黄酮、木脂素、蒽醌等天然产物的分离分析。

具有分离效率高，溶剂用量少，无吸附，样品回收率高，重现性好和适用范围广等优点。5 高效毛细管电泳法 （HPCE） 高效毛细管电泳技术是以高压电场为驱动，毛细管为分离通道，依据样品中各组分淌度和分配行为上的差异而实现高效快速分离的新型电泳技术。

毛细管电泳的广泛应用取决于其多变的分离模式，几乎涉及分析化学中所有的分离对象，小到无机离子，大到蛋白质和高分子聚合物，也能够分析不带电荷的中性物质[7]。具有所需样品少、溶剂消耗少、抗污染能力强、可直接分析水溶液等优点。

其中毛细管区带电泳 （CZE） 和胶束电动毛细管电泳色谱 （MECC） 是中草药分析中最常见的两种模式。但该方法的重现性有待提高。

6 紫外可见光谱 （UV） 紫外可见光谱反映不同化学物质的电子共扼体系特征，具有加和性，对于混合物的鉴别专属性差，分辨率低，故紫外光谱很少用于指纹图谱的构建。7 红外光谱和近红外光谱 （IR） 红外光谱是由分子的振动-转动能级跃迁产生的光谱，红外光谱具有高度的特征性。

近红外光谱法在中药质量控制方面有较好的应用前景。8 核磁共振法 （NMR） 从纯有机化合物的核磁共振氢谱上可获得结构信息，包括各类质子的化学位移、数量核偶合关系。

核磁共振谱具有高度的重现性和特征性，易于解析和进一步研究，可评价药材和中成药质量的均一性和稳定性。9 质谱法 （MS） 将中药提取液置质谱仪中进行电子轰击电离，可获得提取液中化学成分的质谱指纹谱，不同中药提取液所含成分不同，所得质谱图显示的分子离子峰及进一步，裂解碎片峰不一致，可供鉴别。

10 X射线衍射法 物质被X射线照射可产生不同程度的衍射现象，只要某一混合物的组成是恒定的，其衍射图谱可以作为该混合物的特征图谱。该法具有图谱指纹专属性强，信息量大，所需样品量小等诸多优点，X射线衍射法在动物类药材鉴定与辨别中有独特的优势[8]。

11 分子生物学法 （DNA） 利用聚合酶链反应从不同生物样品中人工合成 DNA片断，而这种 DNA片断的大小、数目可因不同的生物而异，故称之为 DNA指纹图谱。该技术具有重复性好、灵敏度高的优点。

限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）是最常用的构建 DNA指纹图谱的方法，但该法费时费力，应用受到限制。随机扩增多态 DNA(RAPD)标记，可以在特异 DNA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性，这是构建中药指纹图谱的新方法，具有极好的应用前景。

罗志勇等[9]采用 RFLP技术，分析了人参、西洋参基因 DNA。

5.中药指纹图谱的分类

狭义的中药指纹图谱是指中药化学（成分）指纹图谱，广义的中药指纹图谱则可按应用对象、测定手段进行不同的分类。 中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学（成分）指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药生物指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱，由于每个物种基因的唯一性和遗传性，中药材DNA指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它对中药材GAP基地建设、中药材种植规范（SOP）、选择优良种质资源和药材道地性研究极为有用。

中药化学（成分）指纹图谱是指测定中药材所含各种化学成分（次生代谢产物）而建立的指纹图谱。虽然化学成分是次生代谢产物，受生物环境和生长年限的影响而产生个体间较为明显的差异，但植物的代谢具有遗传性，作为同一物种的个体在化学成分上也具有相似性（similarity），可以用化学成分的谱图来建立指纹图谱。中药化学（成分）指纹图谱主要有光谱法和色谱法：如紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、质谱（MS）、核磁共振谱（NMR），薄层色谱（TLC）、气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE），以及各种联用技术。中药材化学指纹图谱对控制中药材质量具有更直接、更重要的意义。

6.中药指纹图谱的技术应用

当前，中药指纹图谱技术在世界已成为一种发展趋势。首先是美国食品与药品管理局（FDA）允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图。世界卫生组织（WHO）在1996年草药评价指导原则中也规定：如果草药的活性成份不明，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致。欧共体也将色谱指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制。中国专业技术人员对中药指纹图谱进行了较早的研究。例如广州市药品检验所、北京大学、沈阳药科大学、陕西师范大学、陕西中医药研究院等科研单位均已从不同角度、不同层面对中药指纹图谱技术作了深入研究，有些技术已在实践中得到了应用。

中药指纹图谱技术是符合中医理论及现状的较好的质量控制技术。因为它并不需要详细了解药物的具体活性成份信息，只需要了解个别指标性活性组分信息，以指标性成份峰作为标记，结合非指标成份进行比对，用来综合评价药物质量，既符合中医药理论的整体观点，也满足了对中药质量的可控、保证其疗效的要求。

运用中药指纹图谱和指标成份定量相结合的方式，既可以完善表述中药的整体性特征，又别于西药单一成份定量的质量控制模式，要根据中国的国情，建立自己的中药质量控制体系，评价体系，尽快建立一支高水准、高素质的科研院所和专业技术队伍，使中药指纹图谱技术得以推广和应用。

中药指纹图谱是用多学科交叉、综合技术手段对复杂物质组成体系，质量稳定性进行评价的检测方法。又是分析科学、中药学、分离科学以及化学、生物信息学等二级学科交叉，综合应用研究的结果，是中药现代质量标准体系的核心技术之一，又是解决药品质量控制和监督这一关键问题而采取的一种方法。通过相似性和相关性比对，发展质量变异和缺陷，从而全面特异地把握住中药的质量命脉。又为中药新药研发带来了一种崭新的研究模式，从整体综合的角度把握住了药物多靶点作用及针对性，为新药发现和快速筛选提供了思路和方法。

中药指纹图谱技术主要体现了信息获取、信息处理、信息挖掘三方面的内容。具体的讲，就是从中药物质基础的角度出发，运用现代分离分析科学的手段，获取中药化学指纹图谱。结合药效研究和相关物质成份的分离鉴定，经效谱关系研究，获取中药药效组分指纹图谱，并将已取得的指纹图谱用于中药材，中间体和中药复方制剂的质量控制，以及创新药物研究的实践中，最终解决中药质量评价的科学性和关键问题；解决制约中药发展，走向国际市场的瓶颈问题。

中药指纹图谱质控技术又与GAP基地建设，SOP质量管理息息相关。中药生产标准化是中药产业现代化发展的基础和关键，而中药指纹图谱技术又是中药现代化建设的主要技术手段之一，对中药“安全、有效和质量可控”，保证物种的延续，遗传基因的稳定性，品种的地道性和药用价值起着至关重要的作用。