蛋白质分离层析方法(蛋白质分离纯化的四种方法)

1.蛋白质分离纯化的四种方法

1、盐析法：

盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。

2、有机溶剂沉淀法：

有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。

3、蛋白质沉淀剂：

蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。

4、聚乙二醇沉淀作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。

扩展资料：

蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。

机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20% ，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。

人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸（Amino acid）按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。

参考资料来源：百度百科-蛋白质分离纯化

2.常用的蛋白质分离纯化方法有哪几种

其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量；4）吸附性质.主要有离子交换层析：又称凝胶过滤法、电泳法分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质，分布于不同的液层而分离.常见的分离提纯蛋白质的方法有：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷.3：在蛋白质溶液中加入大量中性盐：利用混合物中各组分理化性质的差异：利用透析袋膜的超滤性质：1，因此在电场中可以移动.6.凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离.2、氯化钠、超速离心.5，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出、甲醇，均可引起蛋白质沉淀.常用的中性盐有，因此不同大小的蛋白质得以分离，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长：硫酸铵，经超速离心后，凝胶层析、盐析与有机溶剂沉淀：1）分子大小.超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好，以破坏蛋白质的胶体性质，称为盐析、分子筛，如乙醇；3）电荷；2）溶解度，蛋白质溶液加于柱之顶部.4、硫酸钠等，吸附层析及亲和层析等，使蛋白质从溶液中沉淀析出、层析法，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比、透析法.盐析时.电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小、丙酮等；5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离：利用物质密度的不同，可将大分子物质与小分子物质分离开，任其往下渗漏。

3.蛋白质的分离方法有哪些

1.根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质，并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。

根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。

透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。

这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。

由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜，也可以选择切向流过滤得到更理想的效果 离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。

当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。

使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度（区带）离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。

可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白，得到的产品纯度高但产量偏低。

蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果，利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析，是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。

凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之，比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。

在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果，纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质（88∶12）、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。

2.根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多，比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下，不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度，根据蛋白质分子结构的特点，适当地改变外部条件，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度，达到分离纯化蛋白质的目的。

常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。

每种蛋白质都有自己的等电点，而且在等电点时溶解度最低；相反，有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。

王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现，pH值为时茶叶蛋白提取效果最好，提取率达到36·8%，初步纯化得率为91·0%。李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4，使目标蛋白于等电点沉淀出来。

等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取。李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3·8。

他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质，得到了最佳的提取工艺为：以1*10-5mol·L-1的NaOH溶液，按1∶5的料液比，在40℃搅拌40 min，葡萄籽蛋白质提取率达73·78%。另外还可以利用碱法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11]。

利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白，蛋白质产率高达90%[12]。 蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象，其中，增加蛋白质溶解度的现象称盐溶，反之为盐析。

应当指出，同样浓度的二价离子中性盐，如MgCl2、（NH4）2SO4对蛋白质溶解度影响的效果，要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质，其最佳提取工艺是：以10%NaCl溶液，按1∶25的料液比，在30℃搅拌提取30min，蛋白质提取率为57·25%[10]。

盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法，其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性，为防止其对蛋白质的破坏，应用氨水调pH值至中性。

为防止不同分子之间产生共沉淀现象，蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后，通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13]。

有机溶剂提取法的原理是：与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇）能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低；而且在一定温度、pH值和离子强度下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此，控制有机溶剂的。

4.蛋白质分离方法有哪些

据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。

透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。

透析是将待分离的混合物放入半透膜知制成的透析袋中，再浸道入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。

这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机回盐为主的小分子分开。

它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。

由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜，也可以选择切向流过滤得到更理答想的效果。

5.蛋白质分离纯化常用的方法

1、沉淀

2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。

3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。

4、层析： a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。 b.分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能同时入孔内而径直流出。

5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。

6.蛋白质分离鉴定的常用方法有哪些

蛋白质分离鉴定的常用方法：‍ 沉淀法 沉淀法也称溶解度法。

其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。 1、盐析法 盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。

2、有机溶剂沉淀法 有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。 3、蛋白质沉淀剂 蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。

4、聚乙二醇沉淀作用 聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。 5、选择性沉淀法 根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。

吸附层析 1、吸附柱层析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。 2、薄层层析 薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。

这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。 3、聚酰胺薄膜层析 聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。

这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。

因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。 离子交换层析 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。

离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。

凝胶过滤 凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

亲和层析 亲和层析的原理与众所周知的抗原-抗体、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的底物（S）才能和一定的酶（E）结合，产生复合物（E-S）一样。

在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶-底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。

实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。

因此，当把固相载体装人小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。

然后，恰当地改变起始缓冲液的pH值、或增加离子强度、或加入抑制剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。

如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差异）时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。

上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。

这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。

聚焦层析 聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。

聚焦层析原理可以从pH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。 1、PH梯度溶液的形成 在离子交换层析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。

例如，当使用阴离子交换剂进行层析时，制备pH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室中装高pH溶液，而在另一室装低pH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的。

7.请简述可用于蛋白质分离纯化的四种方法及其原理

楼主，方法很多，我就挑几个比较有代表的吧

1.亲和层析：利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。

原理：将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。

3.聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于分离蛋白质和寡糖核苷酸。

作用原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：（1）非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

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4.盐析：增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象。是蛋白质分离纯化中经常使用的方法，最常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。

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