真菌性污染的检测方法(微生物室常用的病原真菌检查方法)

1.微生物室常用的病原真菌检查方法有哪些

您好！

1、真菌镜检

是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。其优点在于简便、快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。但是由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断。直 接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。在皮肤刮屑、毛发或甲标本中发现皮肤癣菌、念珠菌和马拉色菌的成分可提供对相应真菌病的可靠诊断。如在无菌体液的 直接镜检中发现真菌成分常可确立深部真菌病的诊断，例如在脑脊液中检测到带荚膜的新生隐球菌酵母细胞，或外周血涂片中检测到荚膜组织胞浆菌细胞。但一般在 有菌部位则只有发现大量真菌菌丝方才有意义，通过直接镜检一般可以区分念珠菌、隐球菌、暗色真菌、毛霉（接合菌）等菌的感染，进一步明确鉴定菌种需要通过 培养鉴定来完成。

2、真菌培养

真菌培养是实验室检查中的重要环节，培养出致病真菌是进一步鉴定菌种的前提条件。真菌培养第一步是从临床标本中培养真菌的初代培养，初代培养后进一步进行 分离纯化培养和鉴定培养。不同致病真菌每一步所采用的培养基，培养时间和培养温度存在一定的差异。常规的真菌培养需要在28-30°C温度下培养3-4 周，一般初代培养选用沙氏培养基（SDA）或者马铃薯琼脂培养基（PDA），采用试管培养，一般同时培养两管，其中一管可添加抗生素（氯霉素或庆大霉素均 可）。在培养1周内，应该每天观察有无真菌生长。一般培养4周后，如果无真菌生长可报阴性。发现培养出真菌，直接挑取少量菌体或者小培养后，用乳酸酚棉兰 制成涂片显微镜下观察，结合菌落大体形态，典型菌种可直接报告种属。不典型菌种根据基本表现，采用适当的标准鉴定培养基，标准培养条件培养，必要时要结合 生理学和分子生物学方法进行鉴定。

3、真菌鉴定

对常见致病真菌要掌握的鉴定原则是首先区分酵母菌和霉菌。

如果初代培养基上培养出酵母样菌落，在鉴定前应进行分离纯化。在去除细菌和其他真菌污染，区分混合感染后，对纯菌落进行鉴定。酵母菌鉴定主要根据形态学特 征和生理生化特点，按照一定的流程进行。首先根据菌落颜色进行分类。临床最为常见的是白色或奶白色菌落，这类菌进一步做芽管试验，若芽管试验是阳性则为白 念珠菌，若阴性则通过Vitek YBC或API20C及玉米吐温琼脂上培养的形态特征来鉴定。另外，还可以应用念珠菌显色琼脂、尿素酶试验等试验来辅助鉴定。

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霉菌的鉴定非常复杂，有许多标准包括形态学特征、温度耐受性，放线菌酮抗性、双相性、营养需求、蛋白分解活动以及水解尿素能力等。现代分类学鉴定方法主要 依据分生孢子的个体发生过程结合其他特征来进行鉴定。初代培养后根据形态学特征一般可鉴定到属的水平，再依据不同真菌的鉴定要求，采用标准培养基和培养条 件进一步完成菌种鉴定。例如：曲霉属鉴定时需要采用标准培养基，即察氏培养基和麦芽琼脂，25℃培养7天后与曲霉形态鉴定检索表对应得到正确的结果。

2.怎样检测环境中的细菌和真菌

1、选取五套培养皿进行实验，一个做为对比，另外四个用来培养不同环境中的细菌，并且是在不同的环境中培养，以便得出细菌和真菌的生存条件。

2、培养皿经过高温灭菌，准备至少5套培养皿。因为对比不同环境中的细菌与真菌的存在情况，是属于单因素比较，所以除了采样地点是变量外，进行微生物培养的条件等也要保持一致

3、经过高温处理后可以将培养皿上、培养基内混有的细菌或真菌的孢子等杀死（经过严格的高温灭菌的环境中是不可能有细菌和真菌存在的），这样就排除了实验外其他环境的污染。因此，在实验前不要盲目的打开培养皿，以防止细菌或真菌的孢子等落在培养基上，实验中用无菌棉棒的目的同样是为了防止棉棒上的微生物污染培养基。

4、在不同的环境中细菌的分布是不相同的，因此在采集菌种的时候要注意选择环境，做到要有一定的代表性。

5、接种好的培养基要放在特定的环境条件下进行培养。

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3.曲霉菌感染检测方法有哪些

GM抗原的检测目前最主流的方法是经典的一步法酶联免疫试验，目前国内外广泛认可的检测产品是由美国Bio-Rad公司提供的曲霉菌抗原检测试剂盒（），可快速、灵敏的发现血液循环中的GM抗原，帮助临床实现早期发现曲霉菌感染。

GM抗原是曲霉菌半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）抗原的简称，是曲霉菌胞壁的组成成分，在菌丝生长过程中可释放人血液，检测患者血清中GM抗原水平有助于侵袭性曲霉菌病（Invasive Aspergillosis, IA）的早期诊断。推荐首次检测时间点一般为当临床怀疑患者发生IA时，或者需要对免疫妥协患者进行常规筛查时。1另外，对于开始进行抗真菌治疗的患者，推荐进行每周两次的GM水平监测，以帮助判断临床疗效及患者预后。2

由于血清学试验为间接检测手段，除外检测试剂盒的选择，感染曲霉菌类型、宿主本身、以及使用的诊断标准和方法等，都可能影响检测结果。所以在检测过程中，需要注意各种影响的因素，以尽可能获得准确的结果，避免出现假阳性或假阴性而干扰了最终的临床诊断，延误患者诊治。在不考虑检测者本身操作原因及试验环境污染等因素的前提下，我们来了解下哪些因素可能会影响试验结果：3

生物学因素：

· 感染部位（比如鼻窦，肺部，还是播散性）

· 感染部位的微环境（比如营养，氧含量，PH值）

· 曲霉菌种类

· 是否使用抗真菌药物

· 释放的GM抗原分子结构

· 患者免疫抑制的程度

· 肾脏清除率，肝代谢情况

· 患者体内是否存在GM抗体

· 样本的保存条件及时间

· 患者检测前的治疗情况

流行病学因素：

· 患者所属人群

· 当地感染流行率

· 样本采集手段

· Cut-off值的设定

· 感染患者的界定标准

· 实验室检测经验

由于对结果的影响因素众多，为了确保最终结果的准确性，选择高质量的检测试剂盒就显得至关重要，即便选择了值得信赖的检测产品，操作者在分析GM抗原检测结果时，还是需要结合各种客观的影响因素，为临床提供最为准确可性的报告。

4.病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

细菌 [what]什么是细菌？细菌（英文：germs;bacteria）隶属生物学一类，是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。

细菌主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等部分构成，有的细菌还有夹膜、鞭毛、菌毛等特殊结构。绝大多数细菌的直径大小在0.5~5μm之间。

可根据形状分为三类，即：球菌、杆菌和螺旋菌（包括弧形菌）。 还有一种利用细菌的生活方式来分类，即可分为两大类：腐生生活与寄生生活。

（一）细胞壁 细胞壁厚度因细菌不同而异，一般为15-30nm。主要成分是肽聚糖，由n-乙酰葡糖胺和n-乙酰胞壁酸构成双糖单元，以β（1-4）糖苷键连接成大分子。

n-乙酰胞壁酸分子上有四肽侧链，相邻聚糖纤维之间的短肽通过肽桥（革兰氏阳性菌）或肽键（革兰氏阴性菌）桥接起来，形成了肽聚糖片层，像胶合板一样，粘合成多层。 肽聚糖中的多糖链在各物种中都一样，而横向短肽链却有种间差异。

革兰氏阳性菌细胞壁厚约20~80nm，有15-50层肽聚糖片层，每层厚1nm，含20-40%的磷壁酸（teichoic acid），有的还具有少量蛋白质。革兰氏阴性菌细胞壁厚约10nm，仅2-3层肽聚糖，其他成分较为复杂，由外向内依次为脂多糖、细菌外膜和脂蛋白。

此外，外膜与细胞之间还有间隙。 肽聚糖是革兰阳性菌细胞壁的主要成分，凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质，都有抑菌或杀菌作用。

如溶菌酶是n-乙酰胞壁酸酶，青霉素抑制转肽酶的活性，抑制肽桥形成。 细菌细胞壁的功能包括：保持细胞外形；抑制机械和渗透损伤（革兰氏阳性菌的细胞壁能耐受20kg/cm2的压力）；介导细胞间相互作用（侵入宿主）；防止大分子入侵；协助细胞运动和分裂。

脱壁的细胞称为细菌原生质体（bacterial protoplast）或球状体（spheroplast，因脱壁不完全），脱壁后的细菌原生质体，生存和活动能力大大降低。 （二）细胞膜 是典型的单位膜结构，厚约8~10nm，外侧紧贴细胞壁，某些革兰氏阴性菌还具有细胞外膜。

通常不形成内膜系统，除核糖体外，没有其它类似真核细胞的细胞器，呼吸和光合作用的电子传递链位于细胞膜上。某些行光合作用的原核生物（蓝细菌和紫细菌），质膜内褶形成结合有色素的内膜，与捕光反应有关。

某些革兰氏阳性细菌质膜内褶形成小管状结构，称为中膜体（mesosome）或间体（图3-11），中膜体扩大了细胞膜的表面积，提高了代谢效率，有拟线粒体（chondroid）之称，此外还可能与dna的复制有关。 （三）细胞质与核质体 细菌和其它原核生物一样，没有核膜，dna集中在细胞质中的低电子密度区，称核区或核质体（nuclear body）。

细菌一般具有1-4个核质体，多的可达20余个。核质体是环状的双链dna分子，所含的遗传信息量可编码2000~3000种蛋白质，空间构建十分精简，没有内含子。

由于没有核膜，因此dna的复制、rna的转录与蛋白的质合成可同时进行，而不像真核细胞那样这些生化反应在时间和空间上是严格分隔开来的。 每个细菌细胞约含5000~50000个核糖体，部分附着在细胞膜内侧，大部分游离于细胞质中。

细菌核糖体的沉降系数为70s，由大亚单位（50s）与小亚单位（30s）组成，大亚单位含有23srrna,5srrna与30多种蛋白质，小亚单位含有16srrna与20多种蛋白质。30s的小亚单位对四环素与链霉素很敏感，50s的大亚单位对红霉素与氯霉素很敏感。

细菌核区dna以外的，可进行自主复制的遗传因子，称为质粒（plasmid）。质粒是裸露的环状双链dna分子，所含遗传信息量为2~200个基因，能进行自我复制，有时能整合到核dna中去。

质粒dna在遗传工程研究中很重要，常用作基因重组与基因转移的载体。 胞质颗粒是细胞质中的颗粒，起暂时贮存营养物质的作用，包括多糖、脂类、多磷酸盐等。

（四）其他结构 许多细菌的最外表还覆盖着一层多糖类物质，边界明显的称为荚膜（capsule），如肺炎球菌，边界不明显的称为粘液层（slime layer），如葡萄球菌。荚膜对细菌的生存具有重要意义，细菌不仅可利用荚膜抵御不良环境；保护自身不受白细胞吞噬；而且能有选择地粘附到特定细胞的表面上，表现出对靶细胞的专一攻击能力。

例如，伤寒沙门杆菌能专一性地侵犯肠道淋巴组织。细菌荚膜的纤丝还能把细菌分泌的消化酶贮存起来，以备攻击靶细胞之用。

鞭毛是某些细菌的运动器官，由一种称为鞭毛蛋白（flagellin）的弹性蛋白构成，结构上不同于真核生物的鞭毛。细菌可以通过调整鞭毛旋转的方向（顺和逆时针）来改变运动状态。

菌毛是菌体表面极其的蛋白纤细，须用电镜观察。特点是：细、短、直、硬、多，菌毛与细菌运动无关，根据形态、结构和功能，可分为普通菌毛和性菌毛两类。

前者与细菌吸附和侵染宿主有关，后者为中空管子，与传递遗传物质有关。 （五）繁殖 细菌一二分裂的方式繁殖，某些细菌处于不利的环境，或耗尽营养时，形成内生孢子，又称芽孢，是对不良环境有强抵抗力的休眠体，由于芽胞在细菌细胞内形成，故常称为内生孢子。

芽孢的生命力非常顽强，有些湖底沉积土中的芽抱杆茵经500-1000年后仍有活力，肉毒梭菌的芽孢在ph 7.0时能耐受100℃煮沸5-9.5小。