如果是两个氨基酸的保留时间距离太近,那么只能调整液相条件了。
比如调整流动相比例,或者是梯度比例,把两个氨基酸拉开。
也可以适当调整衍生程序。
虽然衍生程序不会对氨基酸的保留时间有影响,不过会对它的信号产生影响。
如果这两种氨基酸的峰高有所下降,或许分离度也可以达到要求。
还有就是注意峰型。
衍生化程序很容易损坏色谱柱,超高效色谱的压力又高,色谱柱很容易损毁。
如果峰型不好,建议用纯乙腈低流速反冲色谱柱。
或者是更换新色谱柱。
一、沉淀法:1.利用氨基酸的溶解度分离或等电点沉淀
2.特殊试剂沉淀法
二、离子交换:离子交换是利用不溶性高分子化合物,就是离子交换树脂对不同氨基酸吸附能力的差异对氨基酸混合物进行分组或实现单一成分的分离.
三、萃取:1、反应萃取:选取适当的反应萃取剂,其解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应,生成可以溶于有机溶剂的萃取配合物,从而使氨基酸从水相进入有机相.
2、反相微胶团萃取:反相微胶团是溶在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级的聚体,表面活性剂的极性尾与外在非极性的有机溶剂接触,而极性头则排列在内形成极性核,极性核溶于水后就形成了“水池”,当含有氨基酸的水溶液与反相微胶团的有机溶剂相混合时,氨基酸以带电离子状态进入反相微胶团的水池内而被分离
氨基酸分离的方法还有很多,但是常用的就是离子交换.
全手打,
一、沉淀法:1.利用氨基酸的溶解度分离或等电点沉淀2.特殊试剂沉淀法二、离子交换:离子交换是利用不溶性高分子化合物,就是离子交换树脂对不同氨基酸吸附能力的差异对氨基酸混合物进行分组或实现单一成分的分离.三、萃取:1、反应萃取:选取适当的反应萃取剂,其解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应,生成可以溶于有机溶剂的萃取配合物,从而使氨基酸从水相进入有机相.2、反相微胶团萃取:反相微胶团是溶在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级的聚体,表面活性剂的极性尾与外在非极性的有机溶剂接触,而极性头则排列在内形成极性核,极性核溶于水后就形成了“水池”,当含有氨基酸的水溶液与反相微胶团的有机溶剂相混合时,氨基酸以带电离子状态进入反相微胶团的水池内而被分离氨基酸分离的方法还有很多,但是常用的就是离子交换.全手打,。
氨基酸的分离鉴定——纸层析法
一,实验目的
掌握氨基酸纸层析的方法和原理,学会分析待
测样品的氨基酸成分.
二,实验原理
纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析.滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相.当有机相流经固定相时,物质在两相间不断分配而得到分离.
溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示:
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数.Rf值的大小与物质的结构,性质,溶剂系统,层析滤纸的质量和层析温度等因素有关.本实验利用纸层析法分离氨基酸.
三,实验器材
(1)大烧杯(5000mL):1只/组
(2)微量注射器(100 L):1只/ 组.
(3)喷雾器:公用.
(4)培养皿:1只/组.
(5)层析滤纸(长22cm,宽14cm的新华一号滤纸):1张/组.
(6)直尺,铅笔:自备.
(7)电吹风:1只/组.
(8)托盘,针,白线:1套/组.
(9)手套:1双/组.
(10)塑料薄膜:公用.
(11)小烧杯:50mL,1只/组.
四,实验试剂
(1)扩展剂:将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中,与5体积水混合,充分振荡,静置后分层,弃去下层水层.
(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3种(赖氨酸,苯丙氨酸,缬氨酸),0.5%的待测氨基酸液1种.
(3)显色剂:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.
实验试剂
五,实验操作
检查培养皿是否干燥,洁净;若否,将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干.
(1)平衡:剪一大块塑料薄膜铺在桌面上,将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上,再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中,用塑料薄膜密封起来,平衡20min.
(2)规划:带上手套,取宽约14cm,高约22cm的层析滤纸一张.在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A,在直线上做4个记号,记号之间间隔2cm,这就是原点的位置.另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B,在B线上以A,B两线的交点为原点标明刻度(以厘米为单位),参见左图.
(3)点样:用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样品(每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器,以免交叉污染),点在这四个位置上.挤一滴点一次,同一位置上需点2~3次,2~3mL/次,每点完一点,立刻用电吹风热风吹干后再点,以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm.每人须点4个样,其中3个是已知样,1个是待测样品.
(4)层析:用针,线将滤纸缝成筒状,纸的两侧
边缘不能接触且要保持平行,参见图3-3.向培养皿中加入扩展剂,使其液面高度达到1cm左右,将点好样的滤纸筒直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面在A线下约1cm),罩上大烧杯,仍用塑料薄膜密封.当扩展剂上升到A线时开始计时,每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度,填入表3-1中.当上升到15~18cm,取出滤纸,剪断连线,立即用铅笔描出溶剂前沿线,迅速用电吹风热风吹干.
(5)显色:用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然后立即用热风吹干,即可显出各层析斑点,参见左图.
(6)计算各种氨基酸的Rf值,并判断混合样品中都有哪些氨基酸,各人将自己的实验结果贴在实验报告上,见表3-2.
(7)以层析时间为横坐标,扩展剂上升高度为纵坐标画图,求出扩展剂上升到18cm时所需要的时间.
(8)将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净,倒掉用过的展层液和平衡液,将培养皿洗净,整理好桌面上的仪器和试剂.
氨基酸有必须氨基酸和非必须氨基酸,非必须氨基酸可以在人和动物体内合成,必需氨基酸需依靠食物供给,而植物能合成自身所需的全部氨基酸。
氨基酸合成的公共途径有还原性氨基化作用、氨基转移作用、氨基酸的相互转化作用。 1、还原性氨基化作用 在多数机体中,NH3同化主要是经谷氨酸和谷氨酰胺合成途径完成的。
(1)、谷氨酸合成的主要途径是由L-谷氨酸脱氢酶催化的α-酮戊二酸氨基化途径 (2)、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶联合作用,将游离氨转变为谷氨酸的α-氨基。 2、氨基转移作用 氨基转移作用是由一种氨基酸把它的分子上的氨基转移至其它α-酮酸上。
以形成另一种氨基酸。 植物细胞内存在的转氨作用主要有下列三种: 3、氨基酸的相互转化作用 在有些情况下,氨基酸间也可以相互转化。
如由苏氨酸或丝氨酸可生成甘氨酸,由色氨酸或胱氨酸可生成丙氨酸。 氨基酸的合成需要有氨基和碳架。
氨基是由已有的氨基酸经转氨作用提供的,许多氨基酸均可作为氨基的供体,其中主要的是谷氨酸;碳架来自于糖酵解,三羧酸循环,乙醇酸途径和磷酸戊糖途径的α-酮酸,如α-酮戊二酸、草酰乙酸、丙酮酸和乙醛酸。
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