组织培养的方法(组织培养的具体方法是什么)
1.组织培养的具体方法是什么
一、培养基配制 配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。
自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。
为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。 1.配制几种母液 1.配制MS大量元素母液 一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。
分别称取 NH4NO3 165g KH2PO4 17g KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g MgSO4·7H2O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
2.配制MS微量元素母液 一般将微量元素配制成100倍母液。 依次称取 KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g ZnSO4·7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。 分别称取 CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g 各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。
3.配制MS有机母液 一般配制成100倍MS有机母液。 依次称取 肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g 烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g 盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
4.配制MS铁盐母液 一般配制成100倍MS铁盐母液。 依次称取 EDTA二钠3.73g FeSO4·7H2O2.78g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。 激素母液的配制 各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。
一般取100mg配成100ml母液。 2.配制培养基 以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作： 1.先在烧杯中放入一些蒸馏水。
2.分别取上面八种母液10ml倒入。 3.一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。
4.加蒸馏水用量筒定溶至1L。 5.按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。
所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。 6.用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。
（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。 1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。
1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。 7.称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉），倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。
8.稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。
9.放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。 10.灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。
二、灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。
有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。
这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。
无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。
无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。
灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。
在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。
要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。 常用的灭菌方法可分为物。
2.组织培养的步骤
配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。
自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。
为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。1.配制几种母液1.配制MS大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。
分别称取NH4NO3 165g KH2PO4 17gKNO3 190g CaCl2·2H2O 44gMgSO4·7H2O 37g各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
2.配制MS微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025gH3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025gMnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025gZnSO4·7H2O 0.86g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。分别称取CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。
3.配制MS有机母液一般配制成100倍MS有机母液。依次称取肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
4.配制MS铁盐母液一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取EDTA二钠3.73g FeSO4·7H2O2.78g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。
一般取100mg配成100ml母液。2.配制培养基以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：1.先在烧杯中放入一些蒸馏水。
2.分别取上面八种母液10ml倒入。3.一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。
4.加蒸馏水用量筒定溶至1L。5.按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。
所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。6.用精密试纸或酸度计调整PH至5.7~5.8。
（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。
1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。7.称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉），倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。
8.稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。
9.放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。10.灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。
灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。
有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。
这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。
无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。
无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。
灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。
在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。
要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量。
3.组织培养怎么做,求步骤,求方法
要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。
要选取植物组织内部无菌的材料。这一方 面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。
另一方面要在晴天，最好是中午或下午取 材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消 毒作用，这种组织一般是无菌的。
培养材料的消毒 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成 培养基污染。
因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。
把材 料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料 清洁程度而宜。
易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。
洗时可加 入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的 物质，便于灭菌液的直接接触。
当然，最理想的清洗物质是表面活性物质 — 吐温。第二步是对材料的表面浸润灭菌。
要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70% 酒 精、消毒液、无菌水、手表等。用70% 酒精浸10 ~30s 。
由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70% 酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花 蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70% 酒精处 理稍长的时间。
处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。第三步是用灭菌剂处理。
表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1 —2 种使用见表。第四步是用无菌 水涮洗，涮洗要每次3min 左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0 次左右。
无菌水涮洗作用是免除消毒剂 杀伤植物细胞的副作用注意：①酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精 杀死植物细胞。②老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡5 分钟。
③升 汞的渗透力弱，一般浸泡10 分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。④漂白粉容易导致植物材料失绿，所 以对于幼嫩材料要慎用。
⑤在消毒液中加入浓度为0.08 —0.12% 的吐温20 或80 （一种湿润剂），可以 降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果。灭菌剂 使用浓度（%） 持续时间 （ min ） 去除的难易 效 果 次氯酸钙9~10 5~30 易 很好 次氯酸钠2 5~30 易 很好 氯化汞0.1~1 5~8 较难 最好 抗菌素4~50mg/L 30~60 中 较好 制备外植体 将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。
在操作中严禁用手触动材料。接种和培养 （一）接种 在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种1 -2 个，以防止交叉污染。
（二）封口 接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。（三）温度 培养基大多应保持在25 ℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。
增殖 外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切 段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。
增殖1 个月左右 后，可视情况进行再增殖。根的诱导 继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。
1 个月后即可获得 键壮根系。组培苗的炼苗移栽 试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。
一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3 天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再 栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度 （相对湿度98 %左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。
组织培养中的清洗、消毒灭菌技术 日期：2010 年4 月1 日 来源：互联网 作者：植物组培网 点击：21901 、清洗 植物组织培养用的各种玻璃器皿，特别是培养瓶和盛培养基的器皿，一定要严格清洗，以防油污、重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内，影响培养物的生长。使用过的玻璃器皿应及时清洗，先将污 物如培养基、培养物倒掉，再浸入水中，然后洗涤。
玻璃器皿的洗涤，可根据器皿的污染程度和性质，采 用不同的方法，通常有碱洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必须先进行高压消毒和煮沸，以杀死菌 体，否则会产生孢子飞扬，污染环境，给组织培养带来严重困难。
器皿洗净后，应烘干或晾干，放在规定 的地方，便于取用。常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（ 烘烧和灼烧） 、湿热（ 常压或高压蒸 煮） 、射线处理（ 紫外线、超声波、微波） 、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲 醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。
4.细胞培养的方法有哪些
细胞培养首先分为原代培养和传代培养.
原代培养需要从组织中消化、分离、纯化出单细胞，然后继续进行传代、冻存；
传代培养首先：
细胞复苏：
1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-38度，取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.
2.在无菌台内将完全培养基加入培养瓶内，然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞，置培养瓶内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养，24h后换液；也可复苏当时离心（1000rpm 5min左右）后，完全培养基重悬培养，适时换液.
细胞传代：
1.贴壁细胞：
对于贴壁细胞应先吸（倒）尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱.PBS清洗2-3次，去除血清和死细胞，50ml培养瓶加入消化液约0.6ml，按此比例进行消化，（根据配制强度经验），晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后收集离心（1000rpm 5min左右），新鲜培养基重悬沉淀，加入完全培养基后继续培养或实验.
2.悬浮细胞：
一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度或需更换新培养基，可先离心（1000rpm,5min左右）后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养.
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5.植物的组织培养包括哪些
（一）按外植体的来源分 外植体：是指在植物组织培养过程中，从植物母体上取来，用于离体培养的初始材料。
（1）植株培养 是指对具有完整植株形态的幼苗或较大的植株进行离体培养的方法。 （2）胚胎培养 是指对植物成熟或未成熟胚进行离体培养的方法。
常用的胚胎培养材料有幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房。 （3）器官培养 是指对植物体各种器官及器官原基进行离体培养的方法。
常用的器官培养材料有根（根尖，切段）、茎（茎尖、切段）、叶（叶原基、叶片、子叶）、花（花瓣、雄蕊）、果实、种子等。 （4）组织培养 是指对植物体各部位组织或已诱导的愈伤组织进行离体培养的方法。
常用的组织培养材料有分生组织、形成层、表皮、皮层、薄壁细胞、髓部、木质部等。 （5）细胞培养 是指对植物的单个细胞或较小的细胞团进行离体培养的方法。
常用的细胞培养材料有性细胞、叶肉细胞、根尖细胞、韧皮部细胞等。 （6）原生质体培养 是指对除去细胞壁的原生质体进行离体培养的方法。
（二）按培养过程分 （1）初代培养 将植物体上分离下来的外植体进行最初几代培养的过程。其目的是建立无菌培养物，诱导腋芽或顶芽萌发，或产生不定芽、愈伤组织、原球茎。
通常是植物组织培养中比较困难的阶段，也称启动培养、诱导培养。 （2）继代培养 将初代培养诱导产生的培养物重新分割，转移到新鲜培养基上继续培养的过程。
其目的是使培养物得到大量繁殖，也称为增殖培养。 （3）生根培养 诱导无根组培苗产生根，形成完整植株的过程。
其目的是提高组培苗田间移栽后的成活率。 （三）根据培养基的类型分为： 1、固体培养： 琼脂、卡拉胶等固化。
2、半液半固体培养：固液双层。 3、液体培养：震荡、旋转或静置培养。
（四）根据再生途径分为： 1、愈伤组织途径； 2、芽增殖途径： 3、原球茎途径： 4、体胚发生途径： 集体的就上植物网。
