制备核酸探针的方法(目前常用的核酸探针)

1.目前常用的核酸探针有哪些

核酸探针的种类 1.按来源及性质划分 可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。

作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应（PCR）从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。

将 RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。cDNA探针适用于RNA病毒的检测。

cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。 将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。

但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。 用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用 2.按标记物划分 有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。

放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。

常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。

放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。

目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。 目前应用较多的非放射性标记物是生物素（Biotin）和地高辛（digoxigenin）。

二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质（如酶、荧光素等）进行检测。

地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。

2.核酸分子杂交的主要实验方法有哪些

杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子（heteroduplex）。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。使双螺旋解开成为单链，因此，变性技术也是核酸杂交的一个环节。

杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交，即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素，但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。

3.分子杂交技术的核酸探针标记法

核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针；根据是否使用放射性标记物的与否，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针；根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针；根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。

下面将介绍各种类型的探针及标记方法。 分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。

双链DNA探针的合成方法主要有下列两种：切口平移法和随机引物合成法。1. 切口平移法（nick translation） 当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。

同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性，能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。

最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响： （a） 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。

（b） DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。（c） DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性， 故应使用仔细纯化后的DNA。

材料： 待标记的DNA。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。

试剂：（1）10*切口平移缓冲液：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。(2)未标记的dNTP原液：除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外，其余3种分别溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中，浓度为0.3mmol/L。

(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ（4单位/μ l）：溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。

（5）DNA酶Ⅰ：1mg/ml。(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。

(7)10mol/L NH4Ac。操作步骤：（1） 按下列配比混合：未标记的dNTP 10μl10*切口平移缓冲液 5μl待标记的DNA 1μg[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μlE.coli DNA聚合酶 4单位DAN酶 I 1μl加水至终体积 50μl(2) 置于15℃水浴60分钟。

（3） 加入5μl EDTA终止反应。（4） 反应液中加入醋酸铵，使终浓度为0.5mol/L， 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。

[注意]1、3H,32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。

随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。

通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：（1）Klenow片段没有5'→3'外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针。

（2）反应时对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。（3）反应产物的比活性较高，可达4*109 cpm/μg探针。

（4）随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。材料：待标记的DNA片段。

设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：（1）随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。

(2)10*随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。(3)Klenow片段。

（4）20mmol/L DTT。(5)未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。

(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。(7)缓冲液A:50mmol/L Tris·Cl (pH7.5); 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA (pH8.0); 0.5% SDS。

操作步骤：（1） 200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物（1μl）混合后置于eppendorf管内，水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。（2） 与此同时，尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合下列化合物：20mmol/L DTT 1μl未标记的dNTP溶液 1μl10*随机标记缓冲液 1μl[α-32 P] dATP（比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl） 3μlddH2O 1μl(3) 将步骤（1）eppendorf管中的溶液移到步骤（2）管中。

（4） 加入5单位（约1μl） Klenow片段， 充分混合，在微型离心机中以12000g离心1-2秒， 使所有溶液沉于试管底部，在室温下保温3-16小时。（5） 在反应液中加入10μl缓冲液A后，将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。

同时计算放射比活性。[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。

2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。 用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时，探针序列与被检测序列间有很多错配。

而两条探针互补链之间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。

单链DNA探针的合成方法主要有下列两种：（1） 以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针； （2） 以RNA为模板， 用反转录酶合成单链cDNA探针。1. 从M13载体衍生序。

4.核酸分子杂交的主要实验方法有哪些

杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。

其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子（heteroduplex）。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。

使双螺旋解开成为单链，因此，变性技术也是核酸杂交的一个环节。 杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。

该检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交，即细胞原位杂交。

探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素，但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。

5.有几种核酸标记的方法

通过核酸标记技术可将细胞因子cDNA作为基因探钊检测细胞内细胞因子 基因组 DNA或mRNA。主要有以下几种方法：

1.应用同位素（或非同位素）标记的cDNA探针，检测经Northern blot后细胞因子mRNA水平或采用打点杂交法。

2.应用标记cDNA探钊与细胞或组织切片进行原位杂交，然后进行放射自显影。

3.细胞因子mRNA经反转录为cDNA，用特异性细胞因子引物经聚合酶链反应（PCR）扩增细胞因子cDNA,Southern blot后用标记探针检测特异细胞因子DNA水平。