1.1.常量肉汤稀释法1.1.1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如:需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液,所用抗生素为粉剂,其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为:(182.6 mg*750μg/mg)/1280μg/ml=107.0ml,然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境,保存期不超过6个月。
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准,药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值,特殊情况例外。1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton(MH)肉汤,pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时,应在肉汤中加入2%(W/V)氯化钠,按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤,肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。1.1.4.接种物的制备 有2种方法配制接种物,一是细菌生长方法,用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个,接种于4-5ml的水解酪蛋白(MH)肉汤中,35℃孵育2-6h。
增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准,约含1~2*108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法,对某些苛养菌,如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株,推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。
用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物,并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养,以检查接种物纯度。
1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管(13*100mm)13支,排成一排,除第1管加入1.6mlMH肉汤外,其余每管加入MH肉汤1ml,在第1管加入抗菌药物原液(如1280μg/ml) 0.4ml混匀,然后吸取1ml至第2管,混匀后再吸取1ml至第3管,如此连续倍比稀释至第11管,并从第11管中吸取1ml弃去,第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。
然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml,使每管最终菌液浓度约为5*105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。
1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子,置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h;嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h;对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前,应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好,同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染,质控菌株的MIC值是否处于质控范围。
以肉眼观察,药物最低浓度管无细菌生长者,即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断,与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。
根据NCCLS推荐的分界点值标准,判断耐药(resistant, R)、敏感(susceptible, S)或中介(intermediate, I)。S表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效,禁忌症除外。
R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制,或属于具有特定耐药机理(如β-内酰胺酶),所以临床治疗效果不佳。I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度,疗效低于敏感菌。
还表示被测菌株可以通过提高剂量(如β-内酰胺类药物)被抑制,或在药物生理性浓集的部位(如尿液)被抑制。另外,中介还作为“缓冲域”,以防止由微小的技术因素失控,所导致较大的错误解释。
1.2.微量肉汤稀释法1.2.1.抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。1.2.2.MIC板制备 无菌操作,将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中,第1至第11孔加药液,每孔10μl,第12孔不加药作为生长对照,冰冻干燥后密封,-20℃以下保存备用。
1.2.3.接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液,经MH肉汤1∶1000稀释后,向每孔中加100μl,密封后置35℃普通空气孵箱中,孵育16~20h判断结果。当试验嗜血杆菌属,链球菌属时,孵育时间为20~24h,试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验时孵育时间必须满24h。
此时,第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。1.2.4.结果判断 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
当阳性对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时,应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。
如出现多处跳孔,则不应报告结果,需重复试验。通常对革兰阴性杆菌而言,微量肉汤稀释法测得。
硬度材料局部抵抗硬物压入其表面的能力称为硬度。
早在1822年,Friedrich mohs提出用10种矿物来衡量世界上最硬的和最软的物体,这是所谓的摩氏硬度计。按照他们的软硬程度分为十级:1)滑石 2)石膏 3)方解石 4)萤石 5)磷灰石 6)正长石 7)石英8)黄玉 9)刚玉 10)金刚石各级之间硬度的差异不是均等的,等级之间只表示硬度的相对大小。
试验钢铁硬度的最普通方法是用锉刀在工件边缘上锉擦,由其表面所呈现的擦痕深浅以判定其硬度的高低。这种方法称为锉试法这种方法不太科学。
用硬度试验机来试验比较准确,是现代试验硬度常用的方法。常用的硬度测定方法有布氏硬度、洛氏硬度和维氏硬度等测试方法 硬度是衡量金属材料软硬程度的一项重要的性能指标,它既可理解为是材料抵抗弹性变形、塑性变形或破坏的能力,也可表述为材料抵抗残余变形和反破坏的能力。
硬度不是一个简单的物理概念,而是材料弹性、塑性、强度和韧性等力学性能的综合指标。硬度试验根据其测试方法的不同可分为静压法(如布氏硬度、洛氏硬度、维氏硬度等)、划痕法(如莫氏硬度)、回跳法(如肖氏硬度)及显微硬度、高温硬度等多种方法。
布氏硬度以HB[N(kgf/mm2)]表示(HBS\HBW)(参照GB/T231-1984),生产中常用布氏硬度法测定经退火、正火和调质得刚健,以及铸铁、有色金属、低合金结构钢等毛胚或半成品的硬度。洛氏硬度可分为HRA、HRB、HRC、HRD四种,它们的测量范围和应用范围也不同。
一般生产中HRC用得最多。压痕较小,可测较薄得材料和硬得材料和成品件得硬度。
维氏硬度以HV表示(参照GB/T4340-1999),测量极薄试样。1、钢材的硬度 :金属硬度(Hardness)的代号为H。
按硬度试验方法的不同, 常规表示有布氏(HB)、洛氏(HRC)、维氏(HV)、里氏(HL)硬度等,其中以HB及HRC较为常用。 HB应用范围较广,HRC适用于表面高硬度材料,如热处理硬度等。
两者区别在于硬度计之测头不同,布氏硬度计之测头为钢球,而洛氏硬度计之测头为金刚石。 HV-适用于显微镜分析。
维氏硬度(HV) 以120kg以内的载荷和顶角为136°的金刚石方形锥压入器压入材料表面,用材料压痕凹坑的表面积除以载荷值,即为维氏硬度值(HV)。 HL手提式硬度计,测量方便,利用冲击球头冲击硬度表面后,产生弹跳;利用冲头在距试样表面1mm处的回弹速度与冲击速度的比值计算硬度,公式:里氏硬度HL=1000*VB(回弹速度)/ VA(冲击速度)。
便携式里氏硬度计用里氏(HL)测量后可以转化为:布氏(HB)、洛氏(HRC)、维氏(HV)、肖氏(HS)硬度。或用里氏原理直接用布氏(HB)、洛氏(HRC)、维氏(HV)、里氏(HL)、肖氏(HS)测量硬度值。
2、HB - 布氏硬度; 布氏硬度(HB)一般用于材料较软的时候,如有色金属、热处理之前或退火后的钢铁。洛氏硬度(HRC)一般用于硬度较高的材料,如热处理后的硬度等等。
布式硬度(HB)是以一定大小的试验载荷,将一定直径的淬硬钢球或硬质合金球压入被测金属表面,保持规定时间,然后卸荷,测量被测表面压痕直径。布式硬度值是载荷除以压痕球形表面积所得的商。
一般为:以一定的载荷(一般3000kg)把一定大小(直径一般为10mm)的淬硬钢球压入材料表面,保持一段时间,去载后,负荷与其压痕面积之比值,即为布氏硬度值(HB),单位为公斤力/mm2 (N/mm2)。 3、洛式硬度是以压痕塑性变形深度来确定硬度值指标。
以0.002毫米作为一个硬度单位。当HB>450或者试样过小时,不能采用布氏硬度试验而改用洛氏硬度计量。
它是用一个顶角120°的金刚石圆锥体或直径为1.59、3.18mm的钢球,在一定载荷下压入被测材料表面,由压痕的深度求出材料的硬度。根据试验材料硬度的不同,分三种不同的标度来表示: HRA:是采用60kg载荷和钻石锥压入器求得的硬度,用于硬度极高的材料(如硬质合金等)。
HRB:是采用100kg载荷和直径1.58mm淬硬的钢球,求得的硬度,用于硬度较低的材料(如退火钢、铸铁等)。 HRC:是采用150kg载荷和钻石锥压入器求得的硬度,用于硬度很高的材料(如淬火钢等)。
另外: 1.HRC含意是洛式硬度C标尺, 2.HRC和HB在生产中的应用都很广泛 3.。
微孔板Alamar蓝含量。
1. 细胞贴壁后加入各组细胞温育液和
SMMC-7721细胞以5.0*103/孔加入96孔板。.细胞贴壁后加入各组细胞温育液和alamar。Blue,alamar
2. 肝癌细胞还原
表2。肝癌细胞还原alamar。Blue值(%, n
有关资料:
最小抑菌浓度(MIC)值的判断采用alamar blue染色法,保证抑菌实验终点判断客观准确;并以氟康唑对念珠蓖质控制株MIC测定值作为标准质探指标,测定了山苍子油对临床常见的念珠菌种,包括天然耐唑类抗菌药的克柔氏念珠菌的抗菌效果,测出山苍子油对念珠菌的平均MIC,其中白念珠菌:14.14μg/ML,热带念珠菌:23.22μg/ML,光骨念珠菌:31.24μg/ML,近平滑念珠菌:76.19μg/ML,克柔氏念珠菌:28.30μg/ML;电镜显示山苍子油在1/2MIC时即对天然耐唑类药的克柔氏念珠菌有较强的破坏性作用。
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