培养基的制备实验中用到的消毒方法?(培养基灭菌的方法)

1.培养基灭菌的方法有哪些

培养基的灭菌方法

1、高压蒸汽灭菌：

高压蒸汽灭菌适合于耐高温培养基、接种器械和蒸馏水的灭菌。培养基在爱制备过程中混入各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24h内完成灭菌工作。灭菌时一般是在0.105MPa压力下，温度121℃时，灭菌15~30min即可。消毒时间不宜过长，也不能超过规定的压力范围，否则有机物质特别是维生素类物质就会在高温下分解，失去营养作用，也会使培养基变质、变色，甚至难以凝固。将蒸馏水或自来水装在三角瓶中，装水量一般不超过瓶的2/3，用牛皮纸或硫酸纸包扎封口，然后放入高压锅中灭菌后即为无菌水。 灭菌后的培养基可放到培养室中预培养3d，若无污染现象，则证明灭菌是彻底的，可以使用。暂时不用的培养基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培养基应在1周内用完，其他培养基最多也不要超过1个月。

2、过滤灭菌：

一些植物生长调节剂及有机物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇热容易分解，不能与培养基一起进行高温灭菌，而要使用细菌过滤器滤去其中的杂菌。细菌过滤器与滤膜（孔径0.45微米）使用之前要先进行高压灭菌。过滤后的溶液要立即加入培养基中，若为液体培养基，可在培养基冷却至30℃时加入；若为固体培养基，必须在培养基凝固之前（50-60℃）加入，振荡使溶液与其他成分混合均匀。

2.培养基灭菌的方法有哪些

培养基的灭菌方法 1、高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌适合于耐高温培养基、接种器械和蒸馏水的灭菌。

培养基在爱制备过程中混入各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24h内完成灭菌工作。灭菌时一般是在0.105MPa压力下，温度121℃时，灭菌15~30min即可。

消毒时间不宜过长，也不能超过规定的压力范围，否则有机物质特别是维生素类物质就会在高温下分解，失去营养作用，也会使培养基变质、变色，甚至难以凝固。将蒸馏水或自来水装在三角瓶中，装水量一般不超过瓶的2/3，用牛皮纸或硫酸纸包扎封口，然后放入高压锅中灭菌后即为无菌水。

灭菌后的培养基可放到培养室中预培养3d，若无污染现象，则证明灭菌是彻底的，可以使用。暂时不用的培养基最好置于10℃下保存。

含IAA或GA3的培养基应在1周内用完，其他培养基最多也不要超过1个月。2、过滤灭菌：一些植物生长调节剂及有机物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇热容易分解，不能与培养基一起进行高温灭菌，而要使用细菌过滤器滤去其中的杂菌。

细菌过滤器与滤膜（孔径0.45微米）使用之前要先进行高压灭菌。过滤后的溶液要立即加入培养基中，若为液体培养基，可在培养基冷却至30℃时加入；若为固体培养基，必须在培养基凝固之前（50-60℃）加入，振荡使溶液与其他成分混合均匀。

3.培养基的制备与灭菌的实验中配制培养基时要注意哪些问题

1、常用玻璃仪器的准备 制备培养基所用的吸管、锥形瓶、毛细吸管、平皿等玻璃仪器用前要用肥皂水洗刷后用清水冲洗干净，晾干后备用.（1）平皿用纸或布包好，或装在金属盒内，于121℃高压蒸汽菌3min后烘干，备用.（2）试管管口用棉花塞或硅氟塑料试管塞塞好，再用布或报纸包扎好，121℃高压蒸汽灭菌20℃后烘干，备用.（3）吸管及滴管先用少许棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽内的气体污染），然后用纸包后或装入金属吸管筒内，于121℃高压蒸汽灭菌20min后烘干，备用.其他玻璃器皿均应按上法处理，也应装金属筒内160℃干热灭菌2h后，备用.2、培养基的制备及储存 （1）溶化：一般应放在玻璃器皿或搪瓷齐内.加入蒸馏水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分.在使用干燥培养基时，先将蒸馏水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置10—15min，搅拌，振荡，或延长时间以促进溶解，一般不要热，必要时加热，但时间不宜过长，温度不宜过高，避免某些营养成分被破坏.（2）校正酸碱度（调节pH）：培养基必须有适当的pH.因此测定pH是培养基配制过程中的重要步骤之一，测定pH的标准温度为25士2℃.调节pH可用无菌的1mol/l氢氧化钠溶液或10%碳酸钠溶液、1mol/l盐酸溶液.当调节缓冲液的pH时，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氢氧化钾溶液.灭菌后的pH会比灭菌前的pH升高或降低，一般高压灭菌前培养基的pH会比最终pH调高0.2左右，灭菌后基本合适.因此对培养基、缓冲液、试剂在灭菌前后的pH均进行测定，并记下每次pH的测定结果，有助于积累数据考察每种培养基、缓冲液、试剂对灭菌程序的耐受性，从而指导灭菌前pH的调节.干燥培养基一般已校正过pH，用时也必须再验证.测定时，一般用指示剂滴入培养基观察其颜色的变化，或用pH计校正，如与所需pH不符，可用以上的酸或碱液加以校正.调整pH后要加热过滤，使培养基澄清.（3）培养基的分装：大批量配制时使用的自动分配器须经校准和确认.每次使用前后，均要对分配器的管道系统进行冲洗，在分装无菌培养基前，则要采用无菌硅胶管.固体培养基一般分装在250ml、500ml锥形瓶中，高压灭菌后根据需要分装平皿或试管.平皿：倾注平皿，应在无菌室中放置3—4h，如用塑料平皿须在35℃培养箱 中倒置30—60min.让水蒸汽自然蒸发.斜面：制备低层斜面分装于试管，约占容积1/5，灭菌后趁热斜放在细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装使注意管口和瓶塞上勿沾有培养基，如沾有培养基应用布抹去，以避免污染.高层斜面：制备高层斜面分装于试管，约占试管容积的1/3，灭菌后趁热放置成高层短斜面，待其凝固后应用.分装好的培养基或缓冲液等及时密封后必须在配制当天（2h内最佳）进行灭菌处理.液体、半固体培养基一般在高压灭前分装，约装试管容积的1/3，在灭菌后还要加其他成分的液体、半固体培养基，灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中.培养基的灭菌：培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基的灭菌时间和压力，按其成分不同而定.普通培养基采用121℃、103.42kPa灭菌15min，但容器和装量较大时，应延长至20min.含糖培养基115℃、68.85kPa灭菌30min.含糖、血清、鸡蛋等培养基可用流动蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，连续3d，间歇灭菌.血清或组织液，采用低热56—58水浴1h，连续5—6d灭菌，一些遇高温即被破坏的物质如尿素、腹水等，可用细菌过滤器，过滤除菌.高压灭菌应严格按照操作规程执行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内的空气，再逐渐升压保持预定的压力和时间，达到全部杀灭微生物.以上的灭菌时间和温度要经过验证确认，如不同类型培养基混合一起灭菌时宜采用115℃、68.85kPa灭菌30min为好.。

4.微生物中的培养基的配制与灭菌的具体操作是怎样的

培养基的配制与灭菌 1目的1.1了解并掌握培养基的配制、分装方法1.2掌握各种实验室灭菌方法及技术。

2原理 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。

另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。

加琼脂制成的培养基在98~100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。

3材料3.1器皿及材料 天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。3.2药品试剂 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。

4流程 称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。5步骤5.1培养基的制备5.1.1称量药品 根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。

蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。5.1.2溶解 用量筒取一定量（约占总量的1/2）蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。

待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。

5.1.3调节pH 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。

5.1.4溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分（水需预热）。

注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。5.1.5过滤分装 先将过滤装置安装好（图3-1）。

如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。

分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞， 引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。

固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。5.1.6包扎标记 培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。

在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。5.1.7灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。

普通培养基为121℃20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面（图3-2），斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。

5.1.8倒平板 将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45~50℃，立刻倒平板。5.2灭菌方法 灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。

本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。

通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。5.2.1.高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。

这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15~30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。

一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌（图3-4）。5.2.1.1操作方法和注意事项如下 加水 打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。

立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。

装料、加盖 灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。排气 打开排气口（也叫放气阀）。

用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。升压、保压和降压 当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。

当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达。

5.实验室常用的灭菌方法有哪些

(1)加热灭菌法 利用高温来杀死微生物（超过最高生长温度）的方法。

加热灭菌的原理：当高温作用于微生物时，首先引起细胞内生理生化反应速率加快，机体内对温度敏感的物质如蛋白质、核酸等，随着温度的增高而遭受不可逆的破坏，尽而导致细胞内原生质体的变化、酶结构的破坏，从而使细胞失去了生活机能上的协调，停止了生长发育。随着高温的继续作用，细胞内原生质便发生凝固，酶结构完全破坏，活动消失，生化反应停止，渗透交换等新陈代谢活动消失，细胞死亡。

加热灭菌可分干热灭菌和湿热灭菌两大类。 1）干热灭菌 利用灼烧或干热空气灭菌而没有饱和水蒸气参加的灭菌法称为干热灭菌法。

由于干热灭菌使用方便，方法简单，故在生产上广泛应用。如火焰灭菌法：直接利用火焰把微生物烧死，故又称焚烧灭菌法。

采用此法灭菌既彻底又迅速，但只适用于金属制的接种工具、试管口及污染物品等的处理。热空气灭菌法：即在电热恒温干燥箱中利用干热空气来灭菌。

2）湿热灭菌 即利用蒸汽进行灭菌的方法。湿热灭菌又分为高压、常压、间歇灭菌和巴氏灭菌4种。

①高压蒸汽灭菌 由于高压蒸汽具有较强的穿透力和较常压高的温度，能大大缩短灭菌时间，提高工作效率，加之蛋白质在湿热条件下容易变性，在热蒸汽条件下，细菌的芽孢在120℃，经20~30分钟可全部被杀死。如灭菌材料体积较大，不易被穿透时，可将压力增加到0.152兆帕，延长至1~2小时。

在高压蒸汽灭菌中，灭菌温度随蒸汽压力的增加而升高（图2-6）。 图2-6 高压蒸汽灭菌锅 在使用高压灭菌锅时，要完全排出锅内的空气而以饱和蒸汽代之。

如果空气不排除干净，则锅内温度将低于同样压力下由纯饱和蒸汽产生的温度，影响灭菌效果。 此法适用于各种耐热物品的灭菌，如一般培养基、生理盐水等各种溶液、玻璃器皿、工作服等。

所采用的蒸汽压力与时间，应根据待灭菌物品的性质、体积与容器类型等决定。 ②常压蒸汽灭菌 这是采用自然压力、100℃蒸汽进行灭菌的方法。

它设备简单、成本低，当前使用最广泛。只要砌一个炉灶，买1~2只大锅，上面用砖和水泥砌成，也可用大铁桶、木桶等，体积大小可自行决定，但不宜过大，以装800~1500瓶为好。

设计常压灶时应注意的问题：大小根据生产规模来定，灶顶部最好制成拱圆形，这样冷凝水可沿灶的内壁下流而不会打湿棉塞；灶仓内要有层架结构，以便分层装入灭菌物；灶上应安装温度计，可随时观察灶内温度的变化；因灭菌时间长，锅内水不够蒸发，故容量大的灶要安装加水装置；灶仓的密闭程度要尽可能高，这样既提高灭菌效果，又节省燃料。菇农在生产中还常用一种小型蒸汽发生装置，引出蒸汽后直接通到下边用木条堑起、四周用多层塑料布密封的菌袋堆中进行常压灭菌。

这种方法不用建灶，简便省工（图2-7）。常压灭菌一般水烧开后保持8~10小时，闷一夜即可。

图2-7 简易常压灭菌法 ③常压间歇蒸汽灭菌法 这是利用常压蒸汽反复几次灭菌的方法。具体做法是将待灭菌物品放在锅内，100℃处理1小时左右，杀死微生物的营养细胞，让其冷却至30℃左右，此时芽胞会萌发，再以同样方法加热处理，反复3次，可达到灭菌目的。

该方法可用于不耐高温的药品、营养物、特殊培养基的灭菌。 ④低温巴氏灭菌法 即在60~70℃下，经一定时间，杀死有害微生物的方法。

适应于不耐高温的物品消毒。有些培养基，在高温下遭到破坏，用此法既可杀死致病微生物的营养体，又能使培养基的成分不致受到严重破坏。

食用菌生产中培养料堆积发酵工艺，就是利用这个原理杀死其中的病虫、杂菌。 （2）过滤除菌法 又分液体过滤和空气过滤两种，就是采用机械的方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器，通过机械过滤，只让液体培养基或空气从筛孔流出，各种微生物菌体则留在筛子上，从而达到除菌的目的。

这种方法适用于对热不稳定的体积小的液体培养基（如动物血清、蛋白质、酶、维生素等）及气体的灭菌。超净工作台的工作原理就是将带菌空气通过过滤灭菌形成无菌空气，从风洞中吹出，来造成工作台范围的无菌状态。

过滤灭菌的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。常用的过滤器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的，也有用火棉胶、硝化纤维素滤膜制成的。

（3）辐射灭菌法 利用辐射产生的能量进行杀菌的方法称辐射灭菌。辐射可分电离辐射和非电离辐射两种，α-射线、β-射线、γ-射线、X-射线、中子和质子、微波等属电离辐射，紫外线、臭氧、日光为非电离辐射。

1）紫外线灭菌 紫外线杀菌的原理是利用紫外线的辐射作用。用灯管直接照射细菌使其发生光化学反应，将细菌细胞质诱导形成胸腺嘧啶双聚体，从而抑制DNA的复制而发生变性、致死。

另一方面，空气在紫外线照射下产生的臭氧（O3），也具有一定的杀菌作用。紫外线的有效作用距离为1.2~2.0米。

紫外灯一般悬吊在接种室或培养室的上方，个数依房间大小而定，容1~2个人操作的接种室，安装一个30瓦的紫外灯就可以了。在每次接种前，应将所需的器具一起放入接种室（箱）内，然后打开紫外灯照射。

如果接种室体积较大，开灯照射2小时。