提取动物rna的方法(动物RNA的提取)

1.动物RNA的提取

RNA的提取

一、准备试剂：

氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。

二、操作步骤：

1. 匀浆处理：

a. 组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b. 单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c. 细胞悬液 离心收集细胞，每5-10*106动物、植物、酵母细胞或1*107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2. 将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000*g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000*g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000*g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500*g离心5分钟，弃上清。

10. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS，用枪头吸打几次，55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

三、注意事项：

1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3. 分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600*g离心30-60分钟。

预期产量：1mg组织或1*106细胞提取RNA分别为：

肝和脾6-10μg ，肾3-4μg ，骨骼肌和脑组织1-1.5μg ，胎盘1-4μg ，上皮细胞8-15μg ，成纤维细胞5-7μg 。

2.RNA的提取方法有哪些

通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。

但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。 0 T3 z( F& _, D6 c% ^" h6 Y A6 _RNA提取的一般步骤 - O: Y+ x$ p# s8 U4 M9 S 所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。

但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径：提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。

第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。（ O( g; ^+ K) f+ i& ]% P 实验步骤： * l& d6 s5 e( q1 F( g2 | j, ^0 s 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。

6 D8 }. Q; Y, g* X 1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。 " s% f, `0 [1 d* m! ]0 e2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

& X. P) i) Y; L# u/ [3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc(pH-5.2)或异丙醇。2 @0 d& z7 ?+ i, g1 @ 4、洗涤RNA使用70%乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

3 @% V" o9 v+ I1 J2 o9 k" z5、融解RNA一般使用TE。 ; L5 f. n6 }( S1 t% Z& J6、保存RNA应该尽量低温。

为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。

另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。

用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。

当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M,12,000*g离心5分钟。 & P3 [7 m* ^$ U$ _" ? : F" x u* N( ?( I氯化锂法提取总RNA: " u; }' I! r' ^' ^& l 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片断丢失的缺陷。

# ~* S: }9 `* r4 Z3 P 试验试剂： " d$ r6 Q+ _. I8 Q1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】 7 _8 w1 t" o9 a' q! i4 Z2、悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】 ！ m8 Q4 R, ]& y: b# `7 d试验步骤：7 [6 ?$ `* }; o7 _ Z' { 1、对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂-尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂-尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。& Y) b: E, Q" l/ ^ Q: \$ s 2、匀桨液在0-4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。

x- C6 D- N/ N0 K! t2 a 3、取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液，重复步骤2。 ) y- x) S0 K9 y6 j, e4、沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15-30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。

3 d2 v' i1 ~( ~* D5、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，-20℃放置1小时，5000g离心。 L4 a' Q4 u" l: a* K% Z$ ?( e6、70%乙醇洗沉淀一次。

真空干燥。3 }; r0 [/ Q' G9 q 7、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于-70℃保存。

0 f. X% R( H% B7 g ! y7 j5 u$ C' |) [% ~! J3 D: Q蛋白酶-热酚法6 |" ^0 b* [) P3 S* c4 b4 H4 l 本方法适合于病毒RNA的提取 * I( i+ b# r! K试验试剂： $ ？4 [7 H9 `) J1、蛋白酶K（终浓度50ug/ml）, J5 p l6 V/ t7 [/ I 2、2*缓冲液：1%SDS? 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL9 h, p ] y+ \$ Z) O 试验步骤：# W3 v8 G1 [$ ]5 y 1、提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。 - K0 p/ E' G0 M# Q- z7 n, {# d2、加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭，在65℃保温5分钟后再轻徭。

w! `; W( ~, E: i3 ^3、离心，取上清，氯仿抽提一次。， |（ Z0 d; j2 @7 m+ d2 Q& x H 4、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，-20℃放置1小时，5000g离心（10000g,10min）。

7 [/ w, h2 d6 U$ k5、70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

% A5 Y; {( w% ]3 a* y, O e) P6、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于-70℃保存。植物RNA提取过程中难点的相应对策 植物RNA提取过程中难点的相应对策 ） o5 B7 d/ Q3 _酚类化合物的干扰及对策： 。

3.RNA的提取方法步骤及原理.

RNA抽取一般使用Trizol法抽提：

Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。

Trizol作用原理：

在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。

水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

扩展资料

与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。

RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。

在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA）,rRNA（核糖体RNA）,mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。

参考资料来源：百度百科-RNA

4.提取昆虫RNA有哪些方法

1. 组织取材后，在酒精里泡一下立即放入冻存管，快速放入液氮.实验时，在液氮中将组织研磨成粉末，趁液氮未挥发将粉末转移到EP管.加入1ml Trizol，吸打均匀，静置5min.

2. 加入200微升的氯仿，剧烈震荡30s，室温放置10min，离心15000r/min 4摄氏度 15s.

3. 此时，液体分3层，惜取上清液如EB管，加入等体积异丙醇，充分混匀，静置10min；离心15000r/min 4摄氏度 10min

4. 弃上清液，加冰冷的75%酒精 洗涤2次，每次离心8000r/min 4摄氏度 10min

5. 静置 4分钟 干燥后 加入RNA-FREE 水

（仅供参考）

5.提取制备RNA常用的方法有哪几种,各有何优缺点

常见的RNA提取方法有苯酚法、阴离子去污剂法、LiCl一尿素法、改良的Gomez法、异硫氢酸胍法、CTAB法、热硼酸法及改良热硼酸法、TRIZOL试剂快速提取法。

RNA提取时，就变性剂的选择来说，CTAB(CTAB法)比异硫氰酸胍（RIZOL试剂法）和 SDS（改良热硼酸法）更有效；就CTAB法来说，由于以CTAB为变性剂，同时加入PVP和β一巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制RNase的活性，使用无水乙醇或异丙醇沉淀杂蛋白和总核酸等，然后再选择性地分离出RNA。

6.RNA的提取方法

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb

2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。

3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

4、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）

5、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

6、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。

7、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。

扩展资料：

DNA提取原则：

1、保证核酸一级结构的完整性；

2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

3、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

4、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

参考资料来源：百度百科——DNA提取

7.提取昆虫RNA有哪些方法

组织取材后，在酒精里泡一下立即放入冻存管，快速放入液氮.实验时，在液氮中将组织研磨成粉末，趁液氮未挥发将粉末转移到EP管.加入1ml Trizol，吸打均匀，静置5min.加入200微升的氯仿，剧烈震荡30s，室温放置10min，离心15000r/min 4摄氏度 15s. 此时，液体分3层，惜取上清液如EB管，加入等体积异丙醇，充分混匀，静置10min；离心15000r/min 4摄氏度 10min弃上清液，加冰冷的75%酒精 洗涤2次，每次离心8000r/min 4摄氏度 10min静置 4分钟 干燥后 加入RNA-FREE 水 （仅供参考）。